简述全内反射荧光显微术的原理和应用（图）
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引言：
人类自诞生以来不但在不断的改进自己的生产工具，同时也在不断的改进自己观察世界和了解这个世界的工具，其间显微镜的制造应改说为人类观察微观世界打开了一扇窗户，它可以称得上是人类观察认识世界上的一次革命。此后各种新的观察工具相继问世，使人类对微观世界的认识达到了空前的高度。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响，存在分辨极限，瑞利将之归纳为R ≥0. 61λ/nsinθ ，其中λ为成像光波波长，nsinθ为物透镜的数值孔径，即NA 值，因此光学显微镜空间分辨极限～250nm。于是人们研制了拥有点分辨率0.2nm的电子显微镜。
进入80年代，非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度。但这些显微技术在不同程度上存在系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻等困难，尤其是不能像光学显微术那样提供重要的光学信息（如偏振态、折射率、光谱等）和进行无损伤性生物活体探测，这些因素均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。
近年来人们开发出了一系列光学显微镜如：目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术。其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性，使得这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域有着广泛应用，并将对未来的光测技术的发展和科学的进步产生深远的影响。
其中，全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术，它利用全内反射产生的隐失场来照明样品，从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。
1 全内反射荧光显微术的基本原理
1.1 全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1的介质 进入到折射率为n2的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式n1sini=n2sinr
图1：光在不同介质传播的光路图
若n1大于n2，例如折射率为n1的是玻璃，折射率为n2的是液体溶液。当入射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90°，当入射角大于或者等于临界角时，光不再透射进溶液，而是发生全反射。由Snell定律可知
θ2=90° θc=sin-1（n2/n1） （2）
由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如图2所示
图2：全内反射及消逝波的产生
1.2 消逝波的产生及其特点
从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，叫做消逝波，也称隐失波或倏逝波。它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离Z作指数衰减。可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度Z减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为消逝场（evanescent field）。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长。消逝波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光消逝波。消逝波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm。图2 所示那界面上薄薄的一层为消逝波。
1.3 CCD相机的作用
生物样品的荧光物质全被内反射产生的消逝波照射之后，发出荧光，有一种特制的电荷耦合器件CCD相机进行捕捉的。CCD相机分为两种：制冷型和快速型制冷型CCD非常灵敏，可以实现荧光弱信号的探测；而快速CCD则拥有成像速度很快的优点（当然现阶段很少有CCD 相机能兼有以上两个优点），目前使用CCD探测，可达到的量子产率已到～80% ，成像速率～200Hz（帧/ 秒）。当对活细胞成像时，为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间，需要采用图像增强器。CCD相机的高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能，也成就了其高信噪比。而快速成像特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成其为这方面的优势观察仪器。
2 全内反射显微镜的分型及其结构
全内反射荧光显微镜根据其目镜的不同可分为目镜型和棱镜型。
2.1 棱镜型全内反射荧光显微镜
棱镜型全内反射荧光显微镜就是利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入目镜并被CCD相机捕捉，其光路图如图3所示：其简易光路图如图4所示：
图3 棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图
图4 棱镜型的简易光路图
从光路图我们可以看出，棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜，它也不容易受到入射光信号的干扰，但由于消逝波在Z轴方向上呈指数衰减，只能照射100nm的距离。在探测上，放置样品的空间收到棱镜的限制，另外由于目镜和物镜同样品距离近，因此同其他仪器的配合也受到限制，目前棱镜型全内反射荧光显微镜的发展很慢，在科学研究中一般很少用到。
2.2 物镜型全内反射显微镜
在物镜型全内反射显微术中，显微镜的物镜即作为收集样品荧光信号的接收器，同时又作为发生全内反射的光学器件，如图5和6所示。由于细胞的典型折射率为1.33～1.38 ，因此要想实现全内反射，物镜的NA 必须大于1.38 。表达式为：
NA = nsinθ nsinθ > nsinθc
NA为物镜的数值孔径， n ，θ分别为物镜的折射率（浸没油）和孔径角。θc为发生全反射的临界角。当我们使用为1.4 的透镜物镜时，只有很小的一部分物镜孔径范围（1.4－1.38=0.02）可以被利用，这显然增加了光束校准的难度，同时光束的强度也很难提高。如果我们使用NA1.65 的透镜物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.65－1.38=0.27）可被利用，即有更多的激发光强可以用来产生全反射。
图5 物镜型全内反射荧光显微镜成像系统
图6 激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反射要求，从而实现消逝波照明
物镜型的全内反射荧光显微镜在制作要求的技术很高，它是近年来全内反射荧光显微镜的发展方向，由于它的物镜同收集样品荧光的仪器在同一侧，这有助于同其他的仪器比如原子力显微镜，荧光寿命成像技术等的结合。
3 全内反射荧光显微镜的优势应用和发展展望
全内反射荧光显微镜里用消逝波作为阳品的激发光源，并用有着高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机捕捉样品荧光，因此具有如下优点：1、信噪比高（相对共聚焦显微镜）；2、分辨率高（相对其他的光学显微镜）；3、对生物样本损伤小（相对电镜），可以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势，它的荧光激发深度只在～100nm的薄层范围内，从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像，大大提高了成像速度，可以满足实时成像的要求；另一方面它的图像解释相对于近场，干涉显微成像来说也较简单。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移（FRET）、ATP酶的翻转，聚合物内单个分子的结构变化、以及等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动等多方面。如肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究。另外蛋白的构像的动态变化。全内反射荧光显微术的发展一方面会在加强传统优势的基础上，即动态观察生物大分子的结构、相互作用、物质的分泌，同时在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其他仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。
