植物组织RNA提取的难点及对策

从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。

从文献报道上看，有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA，而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。

对于这些植物材料，用常规的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）难以提取出其RNA。如在用常规的方法提取芒果果实的RNA时未能成功，结果分为三种情况：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能进行体外翻译。研究人员认为在果实成熟时各种酶的活性增强，其中也包含RNase，不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖，芒果果实细胞壁中特殊的成份，以及果实中高含量的多酚化合物都是干扰RNA提取的因素。在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA时，发现RNA与某种未知化合物凝聚成不溶性的复合物，并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光吸收，从而干扰了RNA紫外吸收的测定。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的关键。

1. 酚类化合物的干扰及对策

许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。

1.1 防止酚类化合物被氧化的方法

还原剂法：

一般在提取缓冲液中加入（-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中（-巯基乙醇的浓度可高达2%。（-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。在过夜沉淀RNA时加入（-巯基乙醇（终浓度1%）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。

螯合剂法：

螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO-N=基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。

Tris-硼酸法：

如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（>0.2M）则会影响RNA的回收率。

牛血清白蛋白（BSA）法：

原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原-抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。

丙酮法：

用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。

低pH值（pH5.5）的提取缓冲液可以防止酚类化合物的离子化和进一步的氧化。