细胞电融合的原理和方法

实验目的

动物的游离细胞以及植物成微生物去壁后的原生质体，在电刺激下进行细胞融合，且融合率高、无毒性，操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等优点，是细胞工程手段的又一进展。

实验原理

将制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。

实验用品

一、仪器
JCF-I型细胞电融合仪、细胞融合池、普通离心机、倒置显微镜(或研究用显微镜)，刻度吸管、不锈钢网(200目)、镊子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛细吸智、刻度吸蕾。小烧杯(10m1)、滴瓶、培养皿、毛笔等。

二、药品

甘露醇、氧化钠，纤罐索醇(Onozura R-10)、离析酶(Macerozyme R-10)、蜗牛酶(中科院生物物理所产)、CaCl2、2H2O、MES (2-N-吗啉乙烷磺酸)、葡聚糖硫酸钾等。

实验方法

本实验所有步骤均可在有菌条件下操作。

一、植物原生质体的制备

1、取幼嫩的叶片或充分展开的子叶，先用水洗净并吸去表面的水份，再置入小烧杯中将叶片剪成碎块。

2、将碎块放入1.5％纤维素酶、0.3％离析酶、0.5％蜗牛酶、0.6mol/L甘露醇、50mmol/L CaCl2·2H20、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸钾0.3％，pH5.6的酶液中，置于25℃暗处游离5h(或15℃过液)，游离时间结束时，可镜检原生质体分离情况，如果大多数原生质体还未从组织中释放出来，需增加在酶液中的游离 时间。新出厂的酵在5h内一般就可将原生质体游离出来，但因药品质量问题或存放时间过长，致使酶活力下降，要适当延长酶解时间。

3、将醇解出来的原生质体用不锈钥网过滤，以除去未被酶解的组织，过滤后用0.6M的蔗糖冲洗网上残留的原生质体，然后以200r/min进行离心处理5min。

4、用带长针头的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O，将原生质体混匀。

5、用细头滴管或带长针头的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液，再以300r/min离心10min，此时可见到在上下两液体间的界面处有一层乳白质的带状物，即为纯净的原生质体，其破碎的部份及其它杂质都沉降到离心管底部，用长针头注射器或毛细吸臂分别吸去管底的杂质和蔗蔗糖液以及原生质体上层的 CaCl2液。

6、向离心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液，混匀后以300r/min离心5min去掉上清液，量后用0.6mol/L的甘露醇溶液稀释并调整每毫升含5×104个原生质体。

二、动物细胞的制备

用灭菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸钠0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至100ml）lml，再从鸡的翼下静脉取血0.5--1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2--3ml Alsver液，使总量为4--5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内可供一周内使用，实验时取贮备的鸡血细胞lml，加入4ml85％生理盐水，混匀后以1200rr/min离心5min，去上清液后，最后用0.6mol/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混匀后以上述离心条件洗涤两次，最后用0.6mol/L的甘露醇液将鸡细胞稀释并调整成每毫升含2×105个。

如采用传代培养的骨髓或腹水瘤细胞，可先用0.9％的生理盐水洗涤两次，离心速度为800--1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗涤两次，每次600--800r/min，离心5min，最后用甘露醇调整成每毫升含瘤细胞1×105个。

三、细胞电融合方法

1、仪2S结构和使用方法

JCF-型细胞电融事仪的各项技术参数是通过大量的融合实验数据，并参考岛津公司(日)SSH型电融合装置的参数值而设计的．当打开电源，指示灯亮，并拨通输出开关和正弦输出开关，选择和按下正弦频率按键(共分为0.6、0.8、1.3、1.5MHz五档)，此时将输出电缆与示波器相接，在示波器上即出现高频正弦波形，当左右旋转正弦幅度旋钮，则正弦电压的p-p值，也随之降低和升高，如果将输出电缆与电融合室相接，则细胸相互连接．此时再旋动正弦幅度(即正弦电压)旋扭，则仪器上电压表指针随之升高和降低．如果正弦电压过高，则细胞连接速度加快，并呈串珠状，不利于两细胞融合。

将正弦输出开关搬至“复合输出”档，根据所需功率大小选拔复合输出I或、II档、I档为低功率，II档为高功率；再根据实验要求，选择并按下你所需要的“脉冲宽度”拨键(分1ms，0.2ms、0.1ms、10ms、1us五档)和“脉冲幅度”按键(50V、100V、150V、200V、250V五档)，还配有脉冲幅度旋扭(细调)，调整范围0-50V，可使每档增值50V。

施加脉冲刺激可分为“自控”和“手控”两档，当使用“自控”输出脉冲时，先将开关搬向自控档，然后根据需要选择并按下“脉冲频率按健”(分为2sl次及每秒1次、2次、5次、l0次共五档)，即可自动发送电脉冲；如果将开关搬至“手控”档，需按动“手控”按扭，每按动一次发送一个脉冲。无论自控或手控输出，每个脉冲输出都伴有报鸣音响，将输出端与脉冲示波器连接，则可观察到由脉冲宽度、幅度及脉冲间隔所构成的示波图像，当改变以上有关参数值时，其图像亦发生变化：把开关搬向反向，则产生负脉冲，当脉宽和幅度等值不变时，其图像与正脉冲波形相同，但方面相反，上下对称．将电缆输出端与电融合室的两电极相接，并按上述要求发送一定方波脉冲，细胞受到电刺激后，可产生融合。

2、电融合操作

植物原生质体融合

开启电源，关闭“输出开关”，将开关搬向正弦输出档，此时可根据实验需要，将正弦额度选择在1—1.3MHz，脉冲宽度为0.1ms或)10μs，脉冲幅度为150V，脉冲频率为1次/s，并依次按下各标定按键，最后调整正弦电压(即正弦幅度)旋扭，使电压表处于5-10V处。