免疫组化经验总结

互联网2013-11-25

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做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，从一些在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享下。

以免疫组化实验为例来详述。

从我接触的很多本科生和研究生中发现，他们的确是免疫组化“新手”，他们只注重如何做和最终的结果，但对为什么这样做不太感兴趣。他们常按照网上所说的方法，摸索好的抗体浓度和条件后做出很漂亮的染色结果后，他们就认为自己已经掌握了免疫组化方法了，结果不求上进，更换一种新抗体后或实验出现异常结果后就很难做出来了。当然，免疫组化对于我来说，做过很多，但也不能说什么都会，只不过我做的多了，失败多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的诀窍，拿来与大家进行分享。此外，我个人经验不可能面面俱到，还需要更多有经验的高手一起分享、纠正和补充。在这里，我需要感谢中华病理网、丁香通、小木虫论坛给我很大的帮助，还有上海舜百生物技术人员给我实验很多指导和帮助，让我受益匪浅。

免疫组化个人感悟

1. 其实免疫组化，我个人感觉方法和操作都不是很难，关键是结果出现异常时该如何去解决？我认为首先需要掌握好免疫组化实验的原理，知道每一个操作步骤的目的，这样你才能大胆地去改革和纠正一些错误的步骤，如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。比如温度有4 ℃、室温、37 ℃。我推荐4 ℃最佳，反应最温和，背景较浅；而37 ℃反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。

2. 定位和定性是免疫组化最大的优势。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定位较直接准确、定性灵敏度高，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。

3. 免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。

4. 免疫组化实验一定要设置阳性和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5. 免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我发现许多研究生把网上或者说明书摸索的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也让自己很自傲。

6. 免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。

7. 实验方法需要动手和动脑。经过了反复的动手和动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。必要时去各大论坛或者一些知名公司寻求帮助，个人感觉上海舜田生物技术支持不错，服务质量也很好。

下面先介绍下免疫组化的概念和常用方法，以便让大家对免疫组化更深入地理解和掌握。

概念和常用方法介绍

1. 定义

用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。

2. 原理

根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

3. 分类

1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。

2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中 SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。

4. 目前几种常用免疫组化方法简单介绍

1）免疫荧光方法

是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。

2）免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有 ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。

3）免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。

5. 被检测的物质

组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

6. 特点

1）特异性强

免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA 显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。

2）敏感性高

在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于 ABC 法或 SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3）定位准确、形态与功能相结合

该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。

7. 从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA 的异同

1）Western blotting

蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然 Western blotting 也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。

2）ELISA

酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。

下面介绍下免疫组化方法的具体实验流程步骤。

实验流程简介

一、SP 三步法

1）石蜡切片，常规脱蜡至水。

2）0.3%或 3%H₂O₂ 去离子水（无色液体）孵育 10-30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。

3）蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟

4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议 30 分钟内 4 次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用 3 分钟×3 次。

5）血清封闭：室温 15-30 分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。

6）滴加适当比例稀释的一抗，37 ℃孵育 2~3 小时或 4 ℃过夜（最好复温）。PBS 冲洗，3 分钟×5 次。

7）滴加生物素标记的二抗，室温或 37 ℃孵育 30 分钟-1 h。

8）PBS 冲洗，3 分钟×5 次。

9）滴加 SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或 37 ℃孵育 30 分钟-1 h。

10）PBS 冲洗，3 分钟×5 次。

11）显色剂显色（DAB 等）。

12）自来水充分冲洗。

13）可进行复染，脱水，透明。

14）选择适当的封片剂封片。

二、即用型二步法

1）脱蜡、水化组织切片。

2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。

3）0.3%或 3%H₂O₂ 去离子水孵育 5 分钟-30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS 或 TBS 冲洗。

4）滴加一抗，室温或 37 ℃孵育 30~60 分钟，或 4 ℃过夜，PBS 或 TBS 浸洗3 分钟×5 次。

5）滴加 enhangcer 增强剂，37 ℃ 30 min，PBS 或 TBS 浸洗 3 分钟×5 次。

6）滴加通用型 IgG 抗体-Fab 段-HRP 多聚体，室温/37 ℃孵育 30 分钟-1 h，PBS/TBS 冲洗，3 分钟×5 次。

7）应用 DAB 溶液显色。

8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

三、免疫荧光技术（略）

1. 酶免疫组化的关键环节

1）标本固定，固定的目的是：

① 防止标本从玻片上脱落；

② 除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；

③ 固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用 4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin's液或mDF 液效果较好。

2）脱水、石蜡包埋和制片脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

3）脱蜡和水化

这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60 ℃20 min，然后立即二甲苯 1-3 分别 10 min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先 60 ℃ 3-4 h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4）抗原修复

由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高 pH 的等）。我们实验室一般用微波修复中火 6 miundefined4 次，效果不错。注意微波修复后自然冷却 30 min 左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。

5）细胞通透

目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用 Triton X-100、蛋白酶 k 等通透液。如 Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10 um厚切片）和免疫细胞化学中一般用 Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在 PBS 中加入后终浓度是 0.05%即可，而前者终浓度是 0.5%-1%。石蜡切片 4 um 左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。

6）灭活内源性过氧化物酶和生物素

在传统的 ABC 法和 SP 法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性 POD 一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以 10 min 左右，而 0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般 10~30 min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 可能好在保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4 ℃避光保存。不过，现在已有"第二代即用型免疫组化试剂盒"避免内源性生物素的干扰，推荐使用。

7）血清封闭

组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温 10-30 min。但也要防止封闭过度

8）一抗和二抗浓度和孵育时间

一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4 ℃、室温、37 ℃，其中 4 ℃效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 ℃ 1-2 h，而 4 ℃过夜和从冰箱拿出后 37 ℃复温 45 min。具体条件还要摸索。

二抗孵育条件：二抗一般室温或 37 ℃ 30 min-1 h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在 4 ℃最佳，反应温和，但时间最好超过 16~24 h。

9）抗体稀释液

其实许多实验室抗体稀释液就用一般 PBS 即可，但专用的抗体稀释液中除PBS 成份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA 稳定剂等组份，对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因，我一直用国产的专用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果（提示可能一抗没有结合），最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的 PH 值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。

10）切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）

为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 miundefined3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次5_min。

注意：

① 单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

② 温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；

③ 冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

④ PBS 的 pH 和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议 pH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01 M。（中性及弱硷性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

11）DAB 显色

背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由 DAB 孵育条件决定。DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗 4 ℃过夜）；另一方面就是封闭时间过长。

12）复染

目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。

13）封片

为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

2. 免疫荧光方法中的重要环节

1）冰冻切片制备

建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。

2）组织切片固定

切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10 min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

3）血清封闭

为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30 min。

4）一抗孵育条件

在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4 ℃、室温、37 ℃，其中 4 ℃效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 ℃ 1-2 h，而 4 ℃过夜和从冰箱拿出后 37 ℃复温 45 min。具体条件还要摸索。

5）二抗孵育条件

二抗一般室温或 37 ℃ 30 min-1 h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6）复染

目的是形成细胞轮廓，从而更好对目标蛋白进行定位。一般常用 DAPI 复染。

7）封片

为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。

8）切片清洗为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 miundefined3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次5_min。

注意：

（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；

（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

（4）PBS 的 PH 和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议 pH 在 7.4-7.6浓度是 0.01M。（中性及弱硷性条件（pH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）

9）拍照

有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序；应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以 1~2 h 为宜，超过 90 min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射 3~5 min 后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过 2~3 h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启 15-30 分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中 4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

3. 免疫组化和免疫荧光结果分析：见第一场试验讲座。

案例一 DAB 染色后切片着色一片黄/背景深

背景
奥运会期间我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京购买的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一直用中杉金桥的SP 三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会期间我准备做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感觉比较合适（Santa Cruz公司 1：200），等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺利进行，我又从福州迈新顶了一个 SP 试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又重新从博士德公司买了一小瓶 10 ml。从第二批实验开始，组化实验结果一直显示强背景着色，特异性染色很难辨别。后来我将标本拿到上海舜田生物去做，做了效果很不错，于是我就请教了他们公司从事病理 30 多年经验的花老师，她告诉我应该如何去分析和解决问题，很快我就找到了思路，结果问题终于解决了。

问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？

1. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。

2. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。

3. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5. DAB 孵育时间过长或浓度过高；

6. PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤为重要；

7. 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

我的实际解决方案：

以上的分析可能对于初学者还是不容易的，下面我就把我的排除实验的具体过程与大家进行分享、交流和讨论。

1. 首先排除抗体孵育条件。一般来说，着色效果的好坏与抗体的孵育条件是密不可分的，由于用 SP 法已经做出来过一次且效果不错，因此对于同样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先排除。

2. 其次，DAB 孵育时间是否太长？做出来那一次我是孵育 8 min，后来也是8-10 min，我单独做了一次实验来排除该因素。结果孵育 2.5 min 时先出现背景，而特异性染色较浅，故这不符合常理，一般先出现特异性染色，然后随着时间的延长，会出现非特异性背景着色。

3. 最后，血清封闭的问题？以前我一般孵育 15-30 min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温 1 h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。

4. 此外，我在改进的同时，也对 PBS 清洗不断地延长时间和增加次数，甚至完全参照试剂盒说明书来进行操作（我以前一般一抗 4 ℃过夜且室温复温45 min、二抗 37 ℃ 30 min、SP 反应 37 ℃ 30 min），以及过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我冷静地分析了一下整个实验流程，与第一次做出来相比，只有两个地方做了改动：因血清不够而更换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而重新买了抗体稀释液。

5. 我用 PBS 替代一抗稀释液（我以前还回收抗体，自我觉得抗体稀释液中含防腐剂和蛋白稳定剂），其它步骤和组织切片完全与第一次做出来的一致（包括血清也是老试剂盒内剩余的一点），奇迹出现了：结果很好。因为抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度外，然后就是 pH 值，于是我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和 PBS 的 pH 值，结果是前者偏酸性（<6.0），而后两者均在 7.5 左右。

6. 看来主要祸根是抗体稀释液的 pH 值出问题了，于是我又用 PBS 替代抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，结果还是没有做出来：背景很深。这真把我搞惨了。难道还有什么原因吗？通过仔细分析：一抗一定是结合上去了（老 SP 试剂盒结果很好），问题是二抗没有结合上去也不对（因为最后背景很深，这说明二抗可能也结合上去了），DAB 孵育时间现在只用 1.5 min也是背景深而特异性染色浅，那我又怀疑封闭血清了。

7. 我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，其余试剂（二抗、SP）均用新试剂盒提供的，结果是前一张效果很好，而后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果不佳。看来封闭血清也是罪会祸首之一。结果分析显示：抗体稀释液的 pH 值偏低和封闭血清的失效导致了我的免疫组化结果的不佳，望大家在以后的组化实验中也要注意这两个不太引人注意的关键问题。惨痛的教训，值得引以为鉴。

案例二 DAB 染色后切片着色呈阴性结果

背景
其实免疫组化在 DAB 染色后一般有四种情况：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸（染色不均匀）。而阴性染色是许多初学者经常遇到的头疼问题。我身边有个研究生同学在我们实验室初次涉入免疫组化，听说步骤不难，跟我后面做了几次之后，就自己开始做了，连续做了三次，结果均是阴性染色。很扫兴，不知是什么原因导致的，后来我还是请教了上海舜田生物花老师，她免费提供给我我很大的帮助，解决问题的思路也逐步清晰。

问题及其解答：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？

1. 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不知抗体是进口的还是国产的工作液，怎么这么高稀释度也没能做出阳性结果？另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。

2. 抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火 4 次6_min_试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。

3. 组织切片本身这种抗原含量低；

4. 血清封闭时间过长。

5. DAB 孵育时间过短。

6. 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

7. 开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

我的实际解决方案

1. 首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个最重要的因素是抗原和抗体。

（1）抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过 3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。

（2）石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6 miundefined4 次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。

（3）组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用 1：200 一抗效果很好；但我用 1：200 一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。

2. 其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。

（1）一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的 species reactivity 中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择 rat，而二抗是抗 mouse/rabbit 等均有可能出现阴性结果。

（2）抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议 4 ℃孵育过夜和 37 ℃复温 45 min；二抗我一般 37 ℃ 30 min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。

（3）抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。

（4）重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量：原装抗体一般比较稳定，效果较好；而进口分装次之；工作液可能要注意质量问题。

3、同时，DAB 的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30 min。但一般 3-10 min 最好，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。

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