细胞凋亡检测：形态学特征的检测方法

普通光学显微镜观察方法

（一）苏木素－伊红染色（HE 染色法）

石蜡组织切片的HE染色

1、取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。

2、切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。

3、苏木素染色5min，自来水冲洗。

4、盐酸乙醇分化30s（提插数下）。

5、自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。

6、置伊红液2min。

7、常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。

（二）甲基绿－派诺宁染色法

1、新鲜取材组织固定液中4℃固定3～6小时。

2、直接转入95％乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

3、切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水。

4、置染色液中室温下染片约 1h 。

5、取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。

6、插入丙酮中迅速分化。

7、转入丙酮二甲苯（ 1 ： 1 ）稍洗。

8、 二甲苯透明 2 ～ 3 次。

9、 中性树胶封固。

（三） Giemsa 染色

1、收集细胞（ 1 × 106 ）， PBS 洗 1 次。

2、用细胞涂片离心机制成细胞涂片。

3、甲醇固定 3 ～ 5min 。

4、入 Giemsa 稀释染色液 15 ～ 30min ，冬天在 37 ℃温箱中染色。

5、用磷酸盐缓冲液分色，以镜下控制为准。

6、涂片晾干后用中性树胶封片。

（四）瑞氏（ Wright ）染色

1、收集细胞（ 1 × 106 ）， PBS 洗 1 次。

2、用细胞涂片离心机制成细胞涂片。

3、甲醇固定 3 ～ 5min 。

4、用 Wright 液染色 2min 。

5、入 Wright 磷酸缓冲液稀释液 4 ～ 10min ，然后用蒸馏水冲洗。此时如果颜色较深，可 0.08 ％醋酸分化数秒钟。

6、直立晾干后，用中性树胶封固。

二、透射电子显微镜观察方法

培养细胞的取材和固定

1、常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心， 800 ～ 1000r/min ， 10min 。

2、用 0.01mol/L PBS 5ml 重悬细胞。

3、将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。

4、离心， 2000r/min ， 15 ～ 20min ，使细胞成团。

5、小心吸去上清，加入 2.5 ％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。

6、取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。

7、将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中， 4 ℃（可长期）保存。

8、用 0.1mol/L PBS 缓冲液洗 1 次。

9、1 ％锇酸后固定 30 ～ 60min 。

三、荧光显微镜观察方法

（一）吖啶橙染色法

1、制备活细胞悬液，浓度约为 107 /ml 。

2、取 95 μ l 的细胞悬液，加 5 μ l 的吖啶橙贮存液混匀。

3、吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。

4、荧光显微镜选用激发滤片 BG 12 或 BV 等，阻断滤片用 515nm 或 SP3 。 

（二） Hoechst33258 染色法

1、原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。

2、细胞固定液 4 ℃固定 5min 。

3、蒸馏水稍洗后，点加 Hoechst33258 染色液， 10min 。

4、蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。

5、封片剂封片后荧光显微镜观察。

（三） Hoechst33342 染色法

1、将 Hoechst33342 加入培养的细胞中，终浓度为 10 μ g/ml 37 ℃孵育 30min 。

2、4 ％的多聚甲醛和培养液以 1 ： 3 混合，使多聚甲醛的浓度为 1 ％，固定细胞 5 ～ 10min 。

3、固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。

4、荧光显微镜激发滤片选用 UV 激发滤片，阻断滤片为 400 ～ 500nm 。 

以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：

1、 收集（ 0.5 ～ 3.0 ）× 106 个细胞， 500 ～ 1000r/min ，离心 5min 去上清。

2、PBS 洗 1 次， 500 ～ 1000r/min ，离心 5min 去 PBS 。

3、用 3 ％多聚甲醛 50 μ l 重悬细胞，室温下固定 10min 。

4、PBS 洗 1 次， 500 ～ 1000r/min 离心 5min 去 PBS 。

5、用 15 μ l 的 Hoechst33258 或 33342 重悬细胞，终浓度为 16 μ g/ml ，孵育 15min 。

6、取 10 μ l 放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数 500 个细胞，计算调亡率。