病原性真菌的检测

一、实验目的

了解真菌接种、培养的一般程序；掌握单细胞真菌和多细胞真菌的菌丝、孢子的形态特点；掌握真菌不染色标本直接检查方法。

二、实验内容

（一）真菌的菌落观察

观察真菌菌落的形态特点及颜色有助于病原性真菌的鉴定。一般观察真菌的菌落必需将真菌培养于沙保弱氏培养基（俗称大培养），经数日致十数日的培养后才可看到典型菌落。

1. 材料

（1）临床标本（可疑真菌感染）：毛发或皮屑。

（2）真菌菌种：新生隐球菌，白假丝酵母菌，絮状表皮癣菌。

（3）沙保弱氏葡萄糖斜面培养基（含青、链霉素）。

（4）其它：70%酒精 、无菌生理盐水 、平皿等。

2. 方法

（1）临床标本用70%酒精浸泡数分钟，杀死表面杂菌，以无菌生理盐水洗涤。

（2）将处理过的临床标本和实验室保存菌种分别接种于2~3只含有青、链霉素的沙保弱氏葡萄糖斜面培养基上，对临床标本直接将数根毛发或数块皮屑接种。真菌菌种则用灭菌接种环按斜面培养基接种法接种。

（3）置22~28℃培养2~3w或37℃培养箱中培养3~7d。

（4）一周观察1~2次，临床标本连续培养3w无菌落生长者可报告阴性，如长出菌落，应逐日观察菌落形态及颜色变化。

3. 结果观察

真菌的菌落从形态上可分三大类：酵母菌落、酵母样（型）菌落及丝状菌落。

（1）酵母菌落（观察新生隐球菌培养物）：菌落为圆形、较白色，边缘整齐表面光滑、湿润，假菌丝不伸入到培养基内，和表皮葡萄球菌菌落相似。

（2）酵母样（型）菌落（观察白假丝酵母菌）：表面和酵母菌落相似，但生成的假菌丝伸入培养基内。

（3）丝状菌落：观察各种皮肤丝状菌斜面培养物,菌落表面大都有气生菌丝,肉眼观察呈绒毛状、粉状、棉花样等，故称丝状菌落，色泽多种多样，红色毛菌呈紫红色，铁锈色毛菌呈铁锈色或棕色等，菌落底层有营养菌丝伸入培养基内。

（二）真菌的形态观察

1. 菌丝的形态

（1）梳状菌丝：菌丝一侧有多数短的分枝，间距不等，形如梳子，故名梳状菌丝常见于许兰氏毛菌。

（2）螺旋状菌丝：某些菌丝呈螺旋状弯曲，常见于石膏样小孢子菌和许兰氏毛菌。

（3）球拍样菌丝：在菌丝分节处一端膨大，如网球拍样，常见于小孢子菌（microsporum）及表皮癣菌(epidermophyton)。

（4）结节状菌丝：菌丝缠绕成结节样，常见于奥杜盎小孢子菌等。

（5）鹿角状菌丝：菌丝末端膨大成鹿角状，多见于许兰氏毛菌。

（6）假菌丝：酵母菌（如：白假丝酵母菌）的菌体细胞延长分枝后并不脱落，形成类似菌丝的结构。

2. 孢子的形态

（1）芽生孢子（blastospore）：从母细胞发芽而产生，如新生隐球菌（墨汁染色）。

（2）厚膜孢子(chlamydospore)：是从菌丝产生的一种大而圆形的孢子，于毛癣菌（trichophyton）及小孢子菌中常见。

（3）小分生孢子（micloconidia）：孢子为单细胞性孢子，常直接或由小侧枝连接而生长于菌丝的侧面。毛癣菌中常可见到小分生孢子群集中在分枝菌丝末端，呈葡萄状。也有圆形小分生孢子位于菌丝的旁侧。

（4）大分生孢子（macroconidia）：是一种多细胞性孢子，常为梭形或棒形，多数大分生孢子具有数个横隔，每个横隔即为一个细胞。如絮状表皮癣菌的大分生孢子为粗棍型或卵圆形，末端较粗而钝圆，单一或簇生于菌丝端，大小孢子菌则为梭形大分生孢子。

（5）关节孢子（althrospore）：由菌丝细胞分化成几个长方形的节段而成，胞壁也稍厚些，在陈旧培养物中常可出现。
　　
（三）真菌性皮屑的镜检

直接检查真菌感染的皮屑标本，进行涂片检查，可直接观察到真菌的结构——菌丝和孢子。该法虽不能确定真菌的菌种（少数真菌除外），但却可以直接迅速地确定是否为真菌感染。

1. 材料

（1）患者皮屑标本。

（2）封固液：10%氢氧化钾。

（3）乳酸酚棉蓝染液。

2. 方法

（1）不染色标本的检查

①标本制作：取少量标本于载玻片上，滴加一滴封固液，上覆盖玻片，将载玻片放在火焰上方微加热，使组织或角质溶解，但切勿过热以免产生气泡或烤干．也可将盖片稍加按压，使溶解的组织分散并使其透明，吸去周围溢液避免沾污盖玻片。

②检查先用低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查菌丝、孢子的特征。镜检时用稍弱的光线使视野稍暗为宜、低倍镜下菌丝呈折光性较强、绿色纤维分枝丝状体；高倍镜下，菌丝呈分隔或呈节孢子，有时菌丝末端有较粗短的关节孢子。

（2）乳酸酚棉蓝染色法

取洁净玻片一块，滴加一滴染液，将皮屑标本放于染色液中，加上盖玻片（加热或不加热）后镜检。结果真菌染成蓝色。