荧光分光光度计法测定硫酸奎宁浓度的实验方法与步骤

互联网2013-08-27

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荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、试样量少的特点。本实验的主要目的是通过学习荧光法测定硫酸奎宁，掌握VARIAN荧光分光光度计的使用方法以及利用荧光法进行定量分析。

一、实验目的

1.熟悉VARIAN荧光分光光度计的原理和使用

2.掌握激发光谱和发射光谱的概念及测定方法

3.掌握用标准曲线法进行荧光定量分析

VARIAN荧光分光光度仪

荧光分光光度计基本流程如图：

光谱扫描的实现:

仪器有两套光栅分光系统，根据激发和发射光栅动的形式可形成两种光谱：

激发光谱：激发光栅转动

发射光谱：发射光栅转动

荧光物质的激发光谱

固定发射光波长.以不同波长的入射光激发荧光物质,化合物发射的荧光强度F与入射光波长的关系曲线λ

2.发射光谱 (或荧光光谱 )

固定激发光波长. 化合物发射的荧光中各种波长组分的荧光强度.

二、实验原理

1.硫酸奎宁的分子结构特征

硫酸奎宁属生物碱类抗心率失常药,其分子具有喹啉环结构,可产生较强的荧光,可直接用荧光法测定其荧光强度,由校正曲线求出回归方程进而求出试样中奎宁的浓度.

2.定量依据与方法

(1)定量依据：

在低浓度时,溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系

If = Kc

(2)定量方法:校正曲线法

标准曲线法：

配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度;

三、实验内容

•1.仪器和试剂:

仪器:荧光分光光度计,刻度吸管,容量瓶

试剂:0.1μg/ml硫酸奎宁(仪器室),

100μg/ml硫酸奎宁标准溶液,

硫酸奎宁待测液

0.05mol/l稀硫酸溶液

•2.实验步骤:

1.标准溶液的制备:

精密吸取硫酸奎宁标液(100μg/ml,0.05 mol/L硫酸溶解)1.0、2.0、3.0、4.0及5.0ml分别置于50ml容量瓶中,用0.05mol/L硫酸稀释至刻线,摇匀,制得对照品的标准系列溶液,并计算浓度.

2.待测试样溶液的制备:

吸取硫酸奎宁待测液1.0ml,于50ml容量瓶中,用0.05mol/L硫酸稀释至刻线,摇匀,得待测试样溶液.

3.测定:

(1)用0.1ug/ml的硫酸奎宁测定激发光谱和发射光谱:

开机—打开光谱扫描工作站--方法建立—调零--激发光谱的测定—发射光谱的测定—打印结果

(2)校正曲线法测定试样溶液的浓度:

打开浓度测定工作站--方法建立--校正曲线的测定--试样溶液的测定—打印结果--关机

注意事项：溶液配制过程中需应当规范操作各种容量仪器，防止误差；样品测定时，应该按照从低浓度到浓度的顺序，尽可能的减少测量误差；仪器校正后制作标准曲线的参数应该和测定样品时保持一致