细胞培养器械的清洗与消毒方法

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【实验原理】

在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。毒性物质包括解体的微生物 及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。

【实验目的】

学习并掌握细胞培养 使用的器皿、器械的洗涤和消毒。

【仪器、材料及试剂】

1.仪器：超净工作台，干燥箱，高压锅，过滤器 。

2.材料：紫外灯，0.22μm微孔滤膜。

3.试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，重铬酸钾，浓硫酸。

【操作步骤】

1.清洗

(1)玻璃器皿的清洗

步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进行。

①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。

②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。禁止用去污粉。因其中含有砂粒。会严重破坏玻璃器皿的光洁度。特别注意刷洗瓶角部位。酸浸之前要把洗涤剂冲干净。

③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。

④冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。晾干或烘干备用。对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。

【附】清洁液的配制和使用注意事项

1.清洁液(配方见表2-1)

配方成分

弱酸

次强液

强液

重铬酸钾(g)

清水(ml)

浓硫酸(ml)

硫酸浓度(v/v)

50

1000

90

8%

100

1000

160

14%

60

200

800

80%

①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。

②先将重铬酸钾溶于水(用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解)。

③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重错酸饵液倒入浓硫酸中)。

④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。

由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。

2.矽酸钠洗液

贮存液(×100)

砂酸纳80克加偏磷酸钠9克加热溶在1000ml水中。使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后冲洗，再用2%HCl浸泡2h后，自来水冲洗。矽酸钠洗液较清洁液安全，但价格较贵。

(2)塑料器皿清洗

自来水充分浸泡→冲洗→2%Na0H浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次 →晾干→紫外线照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min)。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa(121.3℃)高压灭菌。

(3)胶塞等橡胶类处理

新购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→ 自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→ 自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→ 蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。

(4)金属器械的清洗

新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以101.3kPa高压15min。

(5)除菌滤器 的处理

用过的滤器 将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。

2.包装

包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好;后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。

①瓶类：硫酸纸罩以瓶口,外罩二层牛皮纸用绳扎紧。

②小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。

③吸管、滴管口用脱脂棉塞上(不要太紧或太松)装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。

④无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。

3.消毒灭菌

严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。

①热灭菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。

②蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高压灭菌10min;布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃)高压灭菌15~20min。

③滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22μm微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。

④紫外线：紫外线的波长为200~300nm，最强是在254 nm，6~15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。

⑤熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾5~7.5g，加甲醛(40%)10~15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时，致少4小时以上。

⑥煮沸消毒：紧密情况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。

⑦化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。常用的有：2%煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3~5%甲醛溶液、75%酒精。