细胞培养用液的配制与消毒

器材与试剂：

干粉型培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤：

(1)水的制备：

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

(2)PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：

1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2 HPO4 ・H2 O 1.56g，KH2 PO4 0.2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

2、移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 　

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于20℃保存以备使用。

(4)青、链霉素溶液的配制与消毒

1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2、具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。　　

3、使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克

(5)RPMI1640的制备与消毒：

1、溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中)，充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品。然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml，使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。　　

2、安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3、抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。　　

4、分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。　　

5、使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。

(6)血清的灭活：　　

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

(7)HEPES溶液：　　

HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。　　

1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：　　

准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。　　

注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20mmol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。

(8)谷氨酰胺：　　

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。　　

一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

(9)肝素溶液的配制：　　

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为­­ ℃ 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

(10)Ⅰ型胶原酶：　　

0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

(11)明胶溶液：　　

因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成 100ml溶液）―即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0.1%的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4℃保存。

(12)其他培养用液的配制：

20ug/ml内皮生长因子

注意事项：

1、配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。　　

2、安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。　　

3、配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。

二、细胞传代培养（消化法）

具体操作：

(1)传代前准备：

1、预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2、用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。　　

3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。　　

4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。　　

5、准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。　　

6、取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。　　

7、从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。　　

8、打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

(2)胰蛋白酶消化：

1、加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。　　

2、 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。　　

3、吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

(3)吹打分散细胞：

1、吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2、吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。　　

3、平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6～8分钟。　　

4、弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

(4)分装稀释细胞：

1、分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

(5)继续培养：    

用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO₂ 培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 

传代细胞培养注意事项：   

1、严格的无菌操作。

2、适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方： 
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH₂ PO₄  0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。

三、细胞的复苏

细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作

(1)实验前准备：

1、将水浴锅预热至37℃。

2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。   

3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

(2)取出冻存管：

1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。   

2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

(3)迅速解冻：  

1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。   

2、约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

(4)平衡离心：  

用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min。

(5)制备细胞悬液：    

1、吸弃上清液。    

2、向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

(6)细胞计数：

细胞浓度以5×10⁵ /ml为宜。

(7)培养细胞    

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO₂ 的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误：

1、水浴锅未预热或者未预热到37℃。

2、水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3、离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4、一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。