抗生素效价的生物测定

抗生素效价的生物测定

　　一、目的要求

　　学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。

　　二、基本原理

　　某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。

　　抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。

管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。

在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。

由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。

　　本实验以龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）产生的土霉素效价测定为例。

　　三、器材

　　黄色八叠球菌（Sarcina flava）；

　　（土霉素效价测定用）培养基，

　　（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，

　　（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；

　　培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶， 0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。

　　四、操作步骤

　　1．pH6．0磷酸缓冲液的配制

　　准确称取KH2 PO4 0．8g和K2 HPO4 0．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。

　　2．标准土霉素溶液的配制

　　精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。

　　3．被测样品溶液的制备

　　精确称取样品20mg左右，先用0．1mol/LHCl2ml溶解，然后再用无菌蒸馏水稀释成估计每毫升含1000单位，再吸取1ml至50 ml容量瓶中加pH6．0磷酸缓冲液至刻度，稀释成估计每毫升含20单位的样品溶液。

　　4．黄色八叠球菌菌液的制备

　　取每周接种一次、用普通琼脂斜面保存的黄色八叠球菌菌种，在试验前一日，将细菌接种于盛有培养基Ⅱ的试管斜面上，于28℃培养24小时后，用培养基Ⅰ约 5ml将菌洗下，即得。

　　5．双碟的制备

　　取直径90mm，高15mm的双碟27个，分别注入已溶解的培养基Ⅱ20ml，摇匀，置水平位置使凝固，作为底层。另取培养基Ⅱ，溶解后冷至48—50℃，加入上述黄色八叠球菌菌液适量（以能得清晰的抑菌圈，使每1ml含土霉素20单位的标准液所致的抑菌圈直径在15—18mm为合适），迅速摇匀，在每个双碟中分别加入5ml此含菌培养基，使在底层上均匀摊布，作为菌层，置水平位置待凝固后，在每双碟中以等距离均匀放置牛津杯6个，用陶瓦圆盖覆盖备用。

　　6．标准曲线的制备

　　取50ml容量瓶9只编号，并向各瓶内分别加入不同量的每毫升含1000单位的标准品溶液，用磷酸缓冲液释稀至刻度，使成每毫升含土霉素8、10、12、16、20、24、28、32、36单位9种浓度的标准品稀释液（表Ⅹ-3）。

　　取上述制备的双碟24个，每碟的6个牛津杯间隔的3杯中各装每毫升含20单位的标准品稀释液，将每3个双碟组成一组，共分8组。在第一组的3个双碟的空杯中各装入每毫升含8单位的标准品稀释液；第二组的空杯中各装入每毫升含10单位的标准品稀释液，依次将8种浓度的标准品稀释液装毕。

共得每毫升含20单位的标准品稀释液72杯，其他各种稀释度的标准品各得9杯，全部双碟盖上陶瓦圆盖后置37℃培养16—18小时。测量各抑菌圈的直径，分别求得每组3个双碟中的每毫升中含20单位标准品抑菌圈直径与其他各种浓度标准品抑菌圈直径的平均值，再求出8组中每毫升含20单位标准品的抑菌圈直径总平均值，总平均值与各组中每毫升含20单位的抑菌圈直径平均值的差数，即为各组的校正数，根据各组校正数将8种浓度的抑菌圈平均值校正。

　　例如：如果8组每毫升含20单位的标准品的抑菌圈直径总平均值为 17．0mm，而每毫升含12单位的一组中9个每毫升含20单位标准品的抑菌圈直径平均为16．8mm，则其校正数应为17．0-16．8=0．2，如果9个每毫升含12单位标准品的抑菌圈直径平均为16．4mm，则校正后应为16．4 0．2=16．6（mm）。以浓度为纵坐标，校正后的抑菌圈直径为横坐标，在双周半对数图纸上绘制标准曲线。

　　7．测定法取上述已制备好的双碟3个，在每碟6个牛津杯间隔的3杯中各装入每毫升含20单位的标准品稀释液，其他3杯中各装入估计每毫升含20单位的样品溶液，盖上陶瓦圆盖，置37℃培养16—18小时，测量各抑菌圈的直径，分别求得标准品稀释液和样品溶液所致的9个抑菌圈直径的平均值，照上述标准曲线的制备方法求得校正数后，将样品溶液所致的抑菌圈直径的平均值校正，再从标准曲线中查得样品溶液的效价，并换算成被测样品每毫克所含的单位数。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　被测样品的效价是每毫升含多少单位？

　　2．思考题

　　（1）什么叫抗生素？它对微生物的作用机制有几种？举例说明之。

　　（2）抗生素效价测定中，为什么常用管碟法测定