细菌16S、23S分子鉴定

随着分子生物学的迅速发展, 细菌的分类鉴定亦从传统的表型分类进入到各种基因型分类水平, 如(G+ C)mo l%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16S rDNA 序列分析等。

rRNA 存在于所有细菌中,rRNA 基因由保守区和可变区组成, 在细菌中高度保守。rRNA 基因包含5’端到3’端的若干种成分, 分别是16S rDNA、间区、23S rDNA、间区和5S rDNA。由于16S rDNA 序列在原核生物中的高度保守性, 对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差。23S rRNA 分子比较大(约3kb 左右) , 并且只有少数种的核酸序列被报道, 尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用。

16S-23S rDNA 间区( In tergen icSpacer Region, ISR ) 由于没有特定功能和进化速率比16S rDNA 大10 多倍近几年来在细菌鉴定和分类方面倍受关注。一些细菌的16S223S rDNA ISR 的数目、大小和序列已经报道, 它们之间的不同使其在细菌系统发育学, 特别是相近种和菌株的区分和鉴定方面占据了一席之地。

PCR-RFLP(PCR Restriction fragment length polymorphism)

通过PCR扩增分枝杆菌染色体上一段DNA，将扩增产物经限制性内切酶消化，将消化的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性。

如对16-23srDNA基因PCR扩增，扩增片段（350bp）经识别4个碱基序列的限制性内切酶HaeⅢ、MPPI酶切消化后进行分析，可以鉴别不同分枝杆菌复合群。对分枝杆菌属特异的16srDNA片段PCR扩增，所得DNA片段(1500bp)经CfoI,MboI,RsaI酶消化，电泳分析酶切谱型也可对分枝杆菌进行鉴定。

热休克蛋白（hsp65）基因保守性较强，存在于所有分枝杆菌，用PCR扩增hsp65的一段基因片段（439bp）并用BstEⅡ和HeaⅡ酶切消化分析34种分枝杆菌，显示出不同分子量的带谱图谱。

Plikayti扩增标本hsp65基因，产生一条1380bp的序列，用BstEⅡ和XhoI消化扩增，19种常见分枝杆菌均产生可鉴别的带型，该方法可鉴定90%以上的致病性分枝杆菌。另外Niemann对 gyrB DNA序列扩增出1020bp的片段，用3种限制性酶酶切可以将结核分枝杆菌复合群分开。用PCR-RFLP的关键在于引物的设计和内切酶的选择。

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细菌如果这里是指狭义的原核微生物鉴定则只能用16SrDNA序列分析，因为23SrDNA是真核生物特有的，所以如果这里细菌是指广义的微生物的话，你要首先把工作分成两块，一块原核微生物用16SrDNA，另一块真核微生物用23SrDNA。

至于发文章的软件个人认为DNA star比较好，国外的科研工作者也有很多用这个软件的，普遍认可这个软件，功能也比较齐全。