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【交流】Gateway的原理

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Gateway也可以被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。

Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL和attR。

这是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白和重组位点。

在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2,大小均为100bp,中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长,在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。

在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因,接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限(2个),同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题,因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的,因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因,影响筛选结果。

同样,目的载体(Destination Vector)也必须和Gateway系统配套,即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2,大小均为125bp,同样也夹着一个ccdB自杀基因。

当需要将目的基因从入门载体(Entry Vector)转移到目的载体(Destination Vector)时,只要将两种质粒混合(线性化能有效提高重组率),加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物,attR2序列和attL2序列发生重组,生成一个融合质粒。

attL1序列再和attR1序列重组,融合质粒分解为两个新的质粒,目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换,得到一个带目的基因的目的载体(生成新的重组位点attB1、B2)和带自杀基因的入门载体(生成新的重组位点attP1、P2)。

反应过程需要25度保温1小时(时间越长,重组率越高,特别是较大的质粒,反应过夜能提高5倍重组效率),蛋白酶K37度处理10分钟,转化。由于带自杀基因的载体不能生长,加上抗生素筛选,转化产物重组率高达90%以上。同样,转化用的菌株必须是不含F附加体的。

由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组,attL2序列只能与attR2序列重组,这个方向的反应称为LR反应。LR反应生成新的位点称为attP1/2(200bp)和attB1/2(25bp)序列。 在一定的条件下,attP和attB序列也能发生重组,生成attL和attR序列,这个反向反应称为BP反应。

当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体,希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时,只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上,在由入门载体转移到其它的表达载体就行。

将含目的基因的Gateway表达载体(attB1—目的基因—attB2序列)与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体(pDONR,注意这个载体不同于入门载体Entry Vector)混合,加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物,25度保温1小时,37度蛋白酶K处理10分钟,根据与上面相同的原理,attP和attB序列也能发生重组,生成带有目的基因的入门载体(Entry Vector)和带自杀基因的表达载体。

同样,由于抗性不同以及自杀基因的作用,只有含目的基因的入门载体能被筛选出来。这即是BP反应。需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素抗性,就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。

使用Gateway系统的第一步即为入门载体的构建,有以下几种方法:

A、 PCR重组克隆

以下列方式合成PCR引物,即GGGG-attB1或者attB2序列(25bp)-基因特异性序列(18到25个碱基或以上),这样在PCR扩增目的基因时就可以直接得到两端带有attB1/2基因的片断。将PCR产物直接与上述的供体载体(带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列)混合,加入BP重组混合酶,25度保温1小时,再37度蛋白酶K处理10分钟,即可转化并得到带有目的基因的入门载体。

当然,这个产物最后是需要测序鉴定的,并且,克隆到入门载体的基因不能表达,所以不能用抗体筛选检测。还有一点值得注意的是,由于attB1的末端(第25个碱基)是T,所以跟在后面的基因特异性序列的头两位碱基不能是AA、AG和GA以免提前出现终止密码。得到的入门克隆中,目的基因两侧具有attL重组位点,可以与任何Gateway?目的载体进行重组。

B、限制性内切酶消化

作为PCR克隆的替代方法,有5种Gateway?入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体,可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白,所有的5个Gateway?入门载体提供了Kozak 序列。此外,pENTR?11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列,便于在大肠杆菌中有效的翻译。

C Gateway?改造过的cDNA文库

如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库,您就可以通过pDONRTM载体和BP ClonaseTM酶混合物进行一个简单的重组反应,很容易地把单个克隆转换成Gateway?入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序,为您节约数小时的时间。SuperScript cDNA文库使用pCMV·SPORT构建,有几种的人组织来源可供选择,这些文库有很大一部分是全长的插入片段,可以完全代表来源mRNA。

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