生物发光和化学发光在生物技术中的应用
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最近的一些分子生物学进展使得一些生物技术工具极大提高了生物发光和化学发光的检测和快速应用。这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程（如基因表达，蛋白质－蛋白质相互间作用和疾病的进程），可应用于临床、诊断、和药物开发等。
而且，结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具，如重组细胞生物传感器，免疫分析和核酸杂交系统。发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置（如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板）以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。
自从20多年前，Marlene DeLuca's第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因（luc基因）的转基因烟草以来，生物发光的应用进入了一个新时代。生物发光和化学发光（BL/CL）的主要特点就在于发光信号的高度可测性，可以用PMT（光电倍增管）和CCD成像系统来检测极少量的光子信号。
BL是属于CL范畴之内，CL反应的特点是高光子产生效率，BL为05-0.8 ，CL为0.1-0.001。因此BL/CL的检测极限可以达到10－18到10－21摩尔，这显然要比其它的光学技术强的多。
BL/CL已经发展出了很多具体的分析方法来诊断目前微摩尔或纳摩尔级的生物样本。通过BL/CL结合酶反应，如氧化酶、脱氢酶和激酶等，就可以达到如此的检测灵敏度。然而，以发光技术为基础的分析主要还仅仅停留在作为一个诊断工具。如果BL/CL的潜能能够得到开发，那么许多稀有的微量样品也可以通过一个便宜、可靠甚至是点对点的方式进行测量。
分子生物学和生物技术持续地进展产生了一些新的BL/CL试剂，包括重组和突变酶及相关基因，可以作为报告剂或探针。这些工具的获得，再加上新的CL高效底物，促进了革新性的生物分析技术的出现，用于许多靶标的超敏感检测。
一、新的BL/CL生物技术工具
新的BL/CL报告基因
报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列，编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。报告基因技术应用到研发BL/CL全细胞生物传感器的原理如图1a。
目前，细菌荧光素酶基因（如陆上的Photorhabdus luminescens和海洋中Vibrio harveyi细菌的lux基因），真核的来自于萤火虫Photinus pyralis和海参Renilla reniformis的luc和ruc基因是广泛应用的BL报告基因。此外，一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。
有意思的是一些新的基因，如那些能够发射红光和绿光的Phrixothrix hirtus荧光素酶，各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。不同的荧光素酶的特性如表1。此外最近克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶（HRP）成为一个新的生物技术工具，在不久的将来有较大的期待。实际上，高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。
双报告基因系统
在多重发光测试中，信号是同时产生，测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是，反应也可以按顺序被促发，如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光素酶双报告基因试剂。双报告系统的原理如Figure 1b.
双重分析的BL/CL分析采用连续的闪烁型（Flash）发光形式，如发光蛋白水母蛋白和acridinium-9-carboxamide标记。这种方法可以在一个反应管里定量两个分析物和测试两个发光反应。因为它建立在flash型的发光上，分析测试需要非常短的时间，所以适用于高通量的筛选。
BL/CL双功能分子
目前已有报道，一个双功能的分子既可以作为萤火虫荧光素酶的底物，又可以作为HRP的底物。通过这种方法，因为不同的发光光谱，就可在同一个反应孔中可以用两个酶标记并独立测试。
通过编码BL酶的基因或发光蛋白基因与第二个基因（编码结合蛋白，如蛋白A，蛋白G，链霉亲和素，或生物素受体肽）形成融合蛋白可以广泛用于免疫分析或免疫印迹。
细菌磁性颗粒（Bacterial Magnetic Particles，BMPs）
一个新的有趣的方法是基于磁性细菌Magnetospirillum magneticum建立的细菌磁性颗粒（BMPs）。通过融合蛋白技术，在细菌表面BMPs展示了其特异的蛋白性能。这个生物技术工具，组合了磁性和生物特异结合特性，可以应用于全自动的CL免疫分析，也可用于核酸的纯化和分析。
生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer）
最近，人们把注意力集中到了活细胞的共振能量转移（RET，resonance energy transfer）技术上。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质－蛋白质之间的相互作用。这些技术是建立在能量转移的基础上，在一个发光或荧光供体和一个荧光受体（如绿色荧光蛋白的突变体GFP）之间会发生能量转移。例如，在一些海洋生物（如水母Aequorea victoria和海参R. reniformis）中自然发生一种能量转移现象――生物发光共振能量转移。在这个过程中，Renilla的荧光素酶（Rluc）在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光（480nm），能够转移能量到GFP的突变体上[增强的黄色荧光蛋白(EYFP)], 随之后者发出530nm的绿光。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近（<100 A°）的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。因为BRET信号是一个比率数，不是一个绝对量，它消除了那些因为由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。
图2. 生物发光共振能量转移(BRET)监测蛋白－蛋白互作。
这个方法已成功地应用于活细胞中受体二聚体形成（如胰岛素受体）和受体间相互作用等研究中。BRET也是一种灵敏地检测方法，可以应用于活细胞内转录激活核蛋白相互作用等研究中。
虽然BRET和FRET特别适合于高通量筛选，被使用于药物开发中，但是此技术目前因为关系到供体和受体间的距离障碍，所以还是有一些缺点。
向微型化分析的方向发展
小型化分析设备，如微矩阵和微流装置，已经得到充分的发展，同时不同的，基于传统的小规模分析的方法也得到进一步发展，如微孔板。
微矩阵
通过荧光检测的核酸微矩阵（基因芯片）是已经成熟建立的分析工具，它革命性地推进了基因分析和医学诊断。因为任何类型配体结合的相互作用（如抗原－抗体，蛋白质－蛋白质，配体－受体）都可以利用蛋白微矩阵，所以蛋白微矩阵越来越成为一种普遍的医学研究、诊断、蛋白组学和药物开发的工具。
现在已经发展了一种CL微矩阵，它是把单克隆抗体点到传统的96孔微孔板的孔底，可以用传统微孔板处理装置来检测细胞因子。最近，每平方厘米包含上千个分子探针的大规模的微矩阵已研发出来，用于免疫检测一些蛋白。多点技术原来就可以点生物特异性的探针和样品于一固体支撑物上，使得可以在一个平面上而无需孔或管来分离样品进行多个免疫分析（即在多个样品中同时检测多个分析物）。
芯片实验室(Lab-On-A-Chip)
微流装置，通常也称之为芯片实验室或微分析系统，包括蚀刻在合适固体上的流体通道（它是用 于快速系列处理分析样品）。最近发展出了大量的CL微流体分析系统，它们有基于固定化酶，抗体或核酸。虽然一次只能分析处理一个样品，但是因为它们的小型化，通过组合多个装置可以提高通量平行分析多个分析测试。因为CL分析仅需要小量样品并且是低密度，所以微小化的CL分析装置设计时对光的收集就已最大化，如利用光纤，或尽可能地把CL检测器方放到接近样品地地方，甚至通过微技术嵌到分析装置上。虽然最近发展的一些基于矩阵的多功能生物芯片包含酶、抗体或核酸到多层和依赖于化学发光和电化学发光检测，这些能够同时进行一定量的多分析物分析测试。
小型化微孔板
通过从传统的96、384和1536微孔板增加孔数可以增加微孔板的微孔密度（图3）。纳升容量的微孔板也可以设计出高度平行分析，如BL的ATP分析。小体积容量孔经常产生操作上的困难，这可以部分通过‘活芯片（living chip）’技术来克服。这种技术组合了高密度微矩阵和微孔基础的分析形式。‘活芯片’ 通过液体表面张力的作用支撑液体，组成一个50纳升通道（每个芯片10000个通道）的二维矩阵。大量的化学、生化或基于细胞的微量反应通过BL/CL影像技术平行监测。
图3. 微孔板上的生物和化学发光(BL/CL)。基于超灵敏的光电耦荷装置（CCD）的成像系统，可以同时测量整个384孔板的BL/CL信号。其中每个孔的信号都会通过对BL/CL数字图象进行软件分析得到精确的定量。通过对直观可视信号的评估，测量得到的BL/CL光信号会被转变成假色，而更加突出不同的光强度，如图所显示。
BL/CL 成像
弱光成像设备是基于超高灵敏度的CCD相机可以检测到由样品表面发生特定的反应后发射出来的光。这些设备不但可以在单分子水平定量发光的强弱，还可以进行定位。[31,32] 他们可以用来分析大样品，比如凝胶、膜、微孔板，培养皿、整个器官或活体动物，其空间解析度（BL/CL信号）可达100-200mm。而通过与光学显微镜的配合，他们还可以用来分析微样品，比如组织切片、单细胞或者微芯片设备，其空间解析度高达0.4mm。虽然保持了高度的检测能力，但是通过选择合适的光学系统可以将光损失最小化。
组织切片和单细胞
原位CL(化学发光)杂交检测方法是基于标记的寡核苷酸探针与目标核酸序列特异性原位杂交，再进行CL检测。这种方法不但可以定位还可以定量检测在细胞或组织中目标序列的数量。目前已发展了数种可以在组织或细胞中单检测或双检测病毒核酸的CL原位杂交方法。[33] 如图Figure 4在人皮肤组织样本中检测人乳突淋瘤病毒（HPV）。 CL显微镜成像比比色或荧光检测技术具有更高的灵敏度，其表现甚至超过同位素。因此，CL检测目前已经成为可以对传染病或其他遗传、癌症等疾病快速早期诊断强有力的工具。
Ex vivo 全组织
作为一种简单而可靠的模式，分离并灌注器官被广泛的应用在各种生物学功能的研究方面。BL/CL成像已经被应用到病生理过程的ex vivo研究中。氧自由基（OFR）相关氧化过程藕耦连而自发产生微弱的光子。超低的发光与增强化学发光，目前已经广泛的应用于研究整体器官氧自由基的形成。目前已发展出一套实时定量的CL成像方法，可以检测分离和灌注鼠肝脏中由于缺血灌注而造成的氧化损伤，[34] 并通过研究第一次揭示了鼠肝脏表面的超氧自由基的空间分布和特异性脱氧剂的作用。光子在穿 透过组织时，会发生光的吸收和散射，以及其他光学现象。为了获得准确可靠的数据，必须考虑到这些因素。
体内全动物
BL/CL反应所产生的可见光可以部分的透过动物组织，因此可以在整体动物的模式下进行成像。BL全体细胞和分子成像作为一种灵敏、可定量、非侵入性的和实时的方法，可以用来对活体动物进行生物学研究，并将对生物技术、分子医学、基因治疗和药物研发等领域产生深远的影响。
图4. 化学发光（CL）原位杂交。使用特异性的地高辛标记基因探针在一个皮肤组织切片中检测到了人乳突淋瘤病毒（HPV）DNA。地高辛抗体会与碱性磷酸酯酶和CL酶底物结合。通过CL原位杂交揭示了HPV DNA的浓度从上皮细胞层底部到表面逐渐增加，这一现象正好与病毒的复制循环相吻合。左图显示的是透射光图象，中图是CL信号，右图显示的是透射光透射图层与CL图象假色图层。刻度尺显示为100nm。
体内基因表达
体内基因表达模式方面的研究。在药物研发领域，科学家通过可发光转基因动物（例如：大鼠或小鼠基因组中整合了修饰的内源基因和BL报告基因）作为人类疾病的模式动物进行目标确认的研究。[35] 例如：目前已经建立了一个转基因小鼠模型，可以监测编码人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）基因的体内转录调控，人细胞色素P450 3A4在药物代谢方面起着重要作用。[36]
传染性疾病
疾病的进程和治疗剂的功效可以通过对小鼠注射BL标记进行评估。例如注射经过修饰的病原微生物，然后对透过动物组织的光进行成像。[37] 使用这种方法，可以检测活小鼠胃肠道内重组的发光沙门氏菌的定殖和不同的喂食物质对其的影响。[38]
肿瘤研究
与药物功效研究相同，肿瘤的生长与转移，可以通过活体中注射BL重组肿瘤细胞，再成像进行监测。[39] 另一种方式，初期的肿瘤和不确定的转移可以通过使用基因工程的发光细胞作为探针进行定位。[40] a human colon carcinoma xenograft 模式中已经开始使用双标记，一个标记检测特定基因的转录活性，另一个组成性表达，作为一个内参照物。[41]
细胞移植
心脏细胞移植中胚胎心脏成肌细胞的位置、数量和存活时间可以在活体动物中进行非侵入行的监测。[42] 体内BL成像同样提供了一种新的可以动态检测移植的人造血干细胞的方法。[43] 其他的生物学过程同样可以通过BL标记后活体成像进行研究，比如细胞凋亡、蛋白-蛋白互作和效应细胞功能等等。使用这种方法可以在活体中进行客观的、可定量的检测，成为药物筛选的一个重要工具。[44] 小鼠模型体内重组的BL大肠杆菌成像 Figure 5。
图5. 体内全动物生物发光（BL）成像。BL重组大肠杆菌在活体小鼠模型中的低光成像。稳定表lux基因的细菌被注射到动物中(1x 107 细胞 mL-1)，再使用基于制冷CCD的相机进行测量，进而进行光信号空间分布的评估。刻度尺显示为1 cm。
BL/CL 生物传感器
BL/CL被作为一个检测系统在生物传感器中使用，严格意义上是指作为生物识别系统中的分析装置并与传导装置接触，相关的酶被固定在各种不同形式的装置上。这些系统主要是基于耦连的酶促反应并引发光子的发射。[45，46]
BL/CL 重组全细胞生物传感器
近来，BL生物传感器的研究急速的发展，主要是应用在遗传工程细胞（细菌，酵母或哺乳动物细胞）中，会针对被分析物质反应产生BL信号。在细胞中引入报告基因融合到一个调控DNA序列后，并在被分析物存在的情况下被激活及紧密调控，如图Figure 1a所示。基于细胞的检测方法的一个重要特性是其可以经得起自动化高通量筛选的检验。
目前已有多种BL全细胞生物传感器用来进行环境监测（如表2）。它们可以检测多种普通的胁迫条件，有毒物质，氧化剂，金属和组织寄生物[47]，和一些可以激活报告基因的分子（例如，内分泌活性物质或者多卤化芳香碳氢化合物）[48] 或其他细胞物质（例如，海藻生体毒素）[48]。全细胞生物传感器可以检测污染物中生物片段（例如，片段可以进入活体细胞并激活特定的反应途径），可以获得以其它分析技术很难获得的环境和毒物学的相关信息。基于BL重组全细胞的检测方法同样可以应用到药物筛选中，可以检测待筛选药物与药物靶点的特异性结合。例如，通过监测报告基因的激活状态可以评估激动剂和对抗剂。这些检测方法为功能性检测，可以在一定的生物学背景中测量待筛选药物在特定胞内途径中的作用，而不是获得简单的结合证据。
同一细胞内可以使用两个报告基因可以单独表达并单独检测。例如，一个生物传感器可以同时检测氧化和基因毒性的损害[49]。我们还研究出一个带有内部反应校正系统的荧光双报告基因生物传感器[50]。两个荧光报告蛋白使用不同的发射光谱。一个报告基因提供了分析信号，而第二个则被用做内参照物。任何以后表达水平的修饰都可以检测生物传感器反应和分析信号校正的非特异性变化。这与环境样品分析显著相关，而环境样品分析正以其影响细胞活性的复杂和多变的基质组成而著称。虽然可以设想其应用前景，但在同一细胞使用两个报告基因的研究目前还很少被报道。
免疫检测
BL/CL已经广泛的应用到免疫检测中进行标记物的超灵敏检测。CL免疫检测不但可以通过以CL分子直接标记抗原或抗体，也可以以CL底物标记可被检测的酶。现在，80%的常规临床分析的免疫检测都是使用酶标记。相比同位素检测，CL检测以其更加灵敏和可检测性获得越来越多的应用。依赖于碱性磷酸酯酶（AP）的CL检测和依赖于辣根过氧化物酶的增强性CL检测是最常用的形式。BL反应也已经被证明是检测酶标记的极为灵敏的方法，依赖于萤火虫荧光素酶热稳定突变体标记的醋酸激酶BL检测可以得到极低的检测极限(8.5x10-23 mol)
作为一种新的生物技术工具，BL/CL免疫检测具有一个光明的前景。BL免疫检测中利用发光蛋白（例如，重组水母蛋白）[52]或者一个编码萤火虫荧光素酶基因片段作为标记[53]。多种双功能生物发光分子已经被准备应用到免疫检测中。例如：通过BL蛋白与生物素蛋白受体多肽融合获得的热稳定萤火虫荧光素酶-生物素复合体[11]；化学抗体与一个特异性抗体和BL标记[12]；通过一个BL蛋白或者一个合适进行CL检测的酶与被检测蛋白或多肽的融合，从而获得BL/CL tracer进行竞争性免疫检测[54，55]。随后的方法将比传统的化学结合的方法更为方便。
这些方法中分析物：标记物恒定1：1的摩尔比非常适合与研发超灵敏的检测方法。融合蛋白已经被用于基于BRET的开放式三明治式BL免疫检测（OS-BLIA），此方法以被证明比基于FRET的检测方法更为灵敏[56]。这种方法是依赖于抗原的抗体重链和轻链的重聚，其分别与Rluc或EYFP融合。
CL 和 BL现在已经越来越多的在蛋白分析的western杂交中使用。例如球蛋白（显性）印迹检测[57]和利用免疫印迹检测牙龈缝流体中伴放线放线杆菌的IgG抗体亚型[58]。
其他各种“闪亮”的生物技术应用
生物处理
可以使用BL作为一个内部参照进行在线持续监测发酵过程。先将BL报告基因引入包含有发酵产物基因的质粒中，再将在线发光检测装置整合到自动发酵系统中，从而可以精确的追踪发酵产物的形成过程[59]。而且，通过引入发光报告基因，可以在工业处理中评估细菌的状态，例如在化学制品批量生产和地下水污染退化(生物治疗)应用中。
酶抑制剂筛选
一种BL检测方法可以用来检测蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一个最优的自然蛋白酶酶切位点)被固化在微孔板空内，作为HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解键后从固态上释放出水母蛋白，从而增加了BL信号[61]。这个系统可以通过在BL融合蛋白中引入特定的酶切位点而针对不同蛋白酶进行抑制剂筛选。
核酸检测
基于CL的检测（例如，AP发光底物1，2-二恶二酮和HRP发光增强性CL底物）仍然对各种DNA诊断技术产生重要的影响。通过与地高辛-地高辛抗体或生物素-链酶素标记结合的基因探针杂交检测越来越多的应用到病毒DNA检测中。多重PCR扩增技术已经用来检测沙眼衣原体、Neisseria gonorrhoeae, Ureaplasmaurealyticumand Mycoplasma genitalium in urine specimens，其检测限度达到1-10 x 10-15 g DNA [62]。PCR与CL检测也被共同用来评估脐带血的母细胞污染[63]。一种核酸测序方法则是基于焦磷酸盐的释放和CL检测[64]。
场流分级法
场流分级法（FFF）作为一种细胞分拣的新技术，可以从复杂的自然基质中分离几少的特异性的活细胞[65]。FFF的诊断应用需要极为灵敏的BL/CL检测[66]。其进一步的应用还包括：同时分离发光细胞或通过遗传工程或使用BL/CL示踪物与细胞膜特异性结合而发光的细胞。
结束语
BL/CL检测已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，适用于多种应用。现在，在很多生物技术领域，BL/CL已经作为一个优秀的基本检测原理得到应用，包括：报告基因技术，基因探针检测。当然，BL/CL技术还可以针对各种医学、制药和环境的目标分析物进行超灵敏检测，正好与目前高通量分析仪器的小型化，生物分析等趋势相吻合。新的BL/CL应用，例如BRET，基因融合，重组全细胞生物传感器和提内全动物成像等等也变得越来越普遍。
伴随着他们这些显著的优点，BL/CL技术同样也有一些缺陷。从实践的观点来看，BL/CL技术与传统的分光光度测定和荧光技术相比，更容易基质的影响。当然，BL/CL检测中的化学反应会被基质中的成分影响（通常是淬灭）。此外，酶或发光蛋白也和CL底物一样，相对荧光分子不稳定。另一个限制因素是，相比分光光度和荧光测量的仪器，BL/CL检测的仪器通常的实验室中此类仪器比较少，特别是需要高灵敏度检测时，所需要的仪器通常非常贵。
随着新的生物技术工具的不断产生，BL/CL将进一步得到发展。其中一部分是对新的BL报告基因的发现、克隆和测序，进而推动多重标记系统的研究。另一部分，分子、突变体或者组织发射红光或近红外光谱，连同具有更高光子效率的CL系统，会成为有力的工具。伴随着小型化、高分辨率、超灵敏度，可同时检测不同发光探针的彩色CCD等技术在检测仪器上的应用，BL/CL应用技术将得到进一步发展。BL/CL结合上其他的发光反应，例如荧光和热发光或photoacustic发光可以进行更为有趣的应用。
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