脐静脉内皮细胞培养

一、试剂和缓冲液配制

1、胎牛血清（氯化十六烷基吡啶）

（1）解冻胎牛血清

（2）在56℃加热30分钟（脱补体作用，盖上瓶）

（3）取25ml上述液体放在无菌的50ml的falcon里分馏

（4）在-20℃冰冻馏份

2、磷酸盐缓冲液（PBS）

（1）无钙镁离子的100ML的PBS（10×）（生命技术）

（2）900ML蒸馏水

（3）2克葡萄糖

（4）在无菌的FALCON里过滤，分馏，在-20℃冰冻

3、胶原蛋白酶（0.2%在PBS溶液里）

（1）把0.2克的胶原蛋白酶溶解于100ML的PBS溶液里

（2）在暗箱（铝箔）里混合10分钟

（3）用氢氧化钠1N调整溶液PH值至7.40

（4）过滤（0.22U）

（5）分馏和冰冻在-20℃

4、保存和运输脐带的缓冲液

（1）PBS 50ML

（2）多粘菌素E，抗敌霉素[多肽类抗生素] 1ML

（3）青霉素G 1ML

5、培养基

（1）M199“stock”M199 Earle 10× 100ml，蒸馏水 900ml

（2）M199“完全”

谷氨酰胺 0.2M 1ML

羟乙基哌嗪乙磺酸 1M 1.5ML

37.5%碳酸氢钠（W/V） 1.8ML

青霉素 1ML

胎牛血清（加热至56℃，离心） 20ML

M199“stock” 加至100ML

在+4℃下保存1周

二、细胞培养

1 术前1天

（1）取一滴纤维结合蛋白覆盖有盖培养皿（35MM，7个/根脐带）

（2）准备3个装有50ML保存脐带缓冲液的容器

2 手术当天

（1）用一个容器装50ML生理纤溶酶，保存在37℃下（bain-marie）

（2）术前准备

取一根脐带（离体3个小时内，平均1小时，剪去夹伤部位）

2个50ML注射器，1个30ML注射器和1个10ML注射器

1个止血钳，2根插管，14号线2CM长，消毒巾，消毒手术刀和无菌手套

手术区域准备：一块床单和无菌手套封套

3  脐带手术操作和培养

（1）用手术刀整齐切断脐带两端

（2）静脉（口径最大的脉管）两端各导入一带有胶管的玻璃导管，用线紧绑（脐带结）

（3）用50ML的注射器吸入PBS液清洗脐带

（4）用30ML的注射器把10ML的0.2%胶原蛋白酶从静脉的一端注入，直到血管充盈为止

（5）当从另一断漏出时，用止血钳紧端口

（6）退出注射器，用止血钳夹紧胶管

（7）把脐带放在在37℃的盛有脐带缓冲液中培养15分钟

（8）其间轻轻的挤压脐带

（9）用10ML完全培养液填满一个50ML的无菌锥形离心管中

（10）用这个锥形离心管收集用40ML的PBS冲洗脐静脉出来的溶液

（11）在1000转/分下离心10分钟

（12）弃上清，再加入20ML的培养液

（13）用30ML带针头的注射器分离细胞（反复吹打推出3次）

（14）取0.1ML细胞悬液在血细胞计数板计数。最后调整细胞数，以0.5-1.5×105/ML接种至24孔培养板中，每孔1ML。培养基应该放进湿度为95%，5%CO2和温度为37℃环境中。接下来的一天，通过更换培养基来把非粘附细胞移除。以后培养基每隔两天更换一次。换液时吸去原培养液的1/2--2/3，加入新鲜培养液。

三、传代培养

待细胞生长成单层后，弃培养液，PBS洗两次。0.01%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，按1：3-1：5传代

四、血管内皮细胞鉴定

用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞， 接种在24孔塑料培养板各孔内4h 后， 大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状， 少数细胞伸展， 48～ 72h 生长最快， 逐渐生长成梭形， 有些细胞排列呈鱼贯状相连， 间有旋祸状排列。核清晰， 呈圆形或椭圆形， 核分裂相多见， 1～ 2 核仁， 胞浆丰富， 内含小颗粒。于3～ 4 d 后融合， 7～ 10 d 胞体呈多角形，相互嵌合， 为单层呈铺路石状排列。

五、注意事项

培养内皮细胞培养基中有两样东西很重要，而且不能省：1.用好的胎牛血清 2.生长因子；此外内皮细胞很容易脱落。例如用M199干粉，加入20％小牛血清或10％胎牛血清，2ug/ml生长因子，10－20代用于实验。

六、VⅢ F相关抗原免疫光法检测：

操作：培养三天至四个星期内，在24 孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5 cm ×0。6 cm ，在盖玻片上点100μl 浓度为5.0 ×105 / ml 的细胞悬液， 在37 ℃，5 %CO2 条件下培养4 h ，使细胞贴壁， 然后加入2ml 培养基继续培养。待内皮细胞生长至近融合状态时，用PBS 洗3 次，每次5 min ，然后加入丙酮，室温下固定10 min ，再用PBS 洗3 次，每次5 min ，干燥后加第一抗体———兔抗人Ⅷ因子单克隆抗体100μl（1 : 50 倍稀释），放入湿盒内37 ℃保温1 h ，同时以磷酸缓冲液替代一抗作阴性对照。用PBS 洗3 次，干燥后加FITC 标记的二抗———羊抗兔IgG ，放入湿盒内37 ℃保温1 h ，用PBS 洗2 次，再用蒸馏水洗一次，干燥后用50 %缓冲甘油封片。然后立即在荧光显微镜下观察，摄片。

理想结果：原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。然后用rhTNFα造成细胞损伤及凋亡，并用药物干预。