T7Select 噬菌体展示系统
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T7Select™ 噬菌体展示系统是Novagen开发的基于T7噬菌体(而非传统的M13)创新的基因发现研究产品。目的序列(C-端)与T7基因10 衣壳蛋白而表达得到的多肽和蛋白即可暴露(展示)与病毒(T7噬菌体)的表面。
复制周期短，细胞质蛋白组装，操作和储存方便，超高克隆效率，以及T7噬菌体强大的天然特性使Novagen的T7Select成为替代传统M13系统的更好选择，用于高效文库构建和亲和淘洗。由于T7噬菌体展示系统能构建和筛查更大的文库，能使研究者更有可能发现“沧海一粟”的目标分子。
该系统以多种产品形式提供，包括T7Select噬菌体克隆试剂盒，包含OrientExpress™ cDNA合成的试剂盒以及T7Select噬菌体克隆系统。
另有12种预制人正常组织和病理组织来源的cDNA文库提供，这些文库都是用T7Select10-3载体构建的。
T7噬菌体展示系统与M13系统有什么区别？
M13和T7噬菌体最大的区别就在于成熟病毒从宿主细胞中释放的方式不同。M13噬菌体在周质中组装，必须经细胞膜分泌；而T7在细胞质中完成组装后直接从细胞裂解出来。因此，任何抑制分泌过程的蛋白和多肽都不能在M13系统中展示，或展示效果很差。
例如，具有带电荷氨基酸残端的疏水蛋白、肽或多肽等，会因穿膜困难而无法展示。T7文库则不受这种序列限制，而且，一般来说T7展示系统表达蛋白或多肽的种类要比M13这样的丝状噬菌体更多。
T7比M13优越主要还是表现在易于操作、表达能力以及亲和淘洗富集等方面。T7虽然要求体外包装但生长极为迅速。T7噬斑形成仅需3小时，比M13系统节约整整1天。M13则在测序方面比T7更方便。
T7噬菌体极为稳定，能在各种严酷的条件下不被破坏，而其它噬菌体常在亲和淘洗的过程中失去活性。因此，在T7系统的结合/洗脱过程中，可选用的试剂种类较广泛，亲和淘洗后噬菌体仍然保持很高的感染活性。
产品应用
许多基于多肽或蛋白功能来获得其编码cDNA的研究多可以选用噬菌体展示技术，例如：
蛋白相互作用(例如激素，抗体，受体)
酶分析，酶抑制
核酸-蛋白相互作用
抗原决定簇作图
突变分析
特点与优点
| 独有的产品 | 是唯一采用T7为载体的噬菌体展示系统，没有市售同类产品。 |
| 独有的预制文库 | 预制cDNA文库是Novagen特有的亲和掏洗产品，其它商业化亲和掏洗文库是多肽文库而非cDNA文库。 |
| 操作方便 | 提供完备的cDNA合成、克隆、包装、表达和亲和掏洗的高质量试剂盒以及详细的优化操作步骤指导。 |
| 大通量亲和淘洗 | T7极其稳定，在亲和掏洗时可以采用各种试剂以将噬菌体从固相结合物上释放下来，例如1% SDS，5 M NaCl，4 M尿素，2 M盐酸胍，10 mM EDTA，100 mM DTT，pH 4-10。 |
| 高代表性文库构建与展示 | 采用高效包装提取物和T7克隆试剂盒能轻易地构建大的展示文库。 |
| 有高、中、低拷贝表达供选择 | 用户可以根据表达和亲和掏洗(蛋白结合)的具体要求方便地选择相应的高拷贝或低拷贝表达载体: T7Select系统提供多种在T7表面以高、中、低拷贝表达蛋白的T7噬菌体载体。极高拷贝数(415-1载体为415拷贝)载体适合用于小、低亲合力的结合域。低拷贝数(1-1b和1-2a-c载体为0.1-1拷贝)载体适合用于分析高亲和力结合域。新推出的中拷贝展示载体(10-3)可以中等拷贝数展示(5-15)，使T7Select系统也可以用于分析中等亲和力的结合。 |
| 节省经费 | 试剂盒组成完整，价格合理(例如，T7Select OrientExpress Systems)，可以为用户节省更多费用。 |
| 展示广谱的蛋白及多肽 | 有可以展示多肽或多达1200氨基酸的蛋白的载体供选择 |
| 对蛋白类型无限制 (与M13不同) | 可表达的蛋白的种类比M13系统更多。T7展示的蛋白(或多肽)输出无需经过分泌途径。像b-gal等之所以不能用M13这样的丝状噬菌体展示原因正在于此。序列非依赖型。 |
| 毒性蛋白问题 | 可选择高拷贝或低拷贝表达 |
| 快速 | T7 生长快，节约克隆和筛查时间，3小时内即可形成噬斑。 |
| 完整的文库 | 包装效率高，文库代表性好。 |
| 更强大的蛋白展示功能 | 蛋白通过C-端融合表达而不是通常的N-端融合。插入片段被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，因此，即使插入片段内含有终止密码子也可以被表达和展示。这在必须在N-端克隆的M13是无法进行的。N-端融合克隆cDNA时常会造成麻烦，因为poly(A)区( cDNA中为oligo d(T))常位于翻译终止密码子的下游。 |
T7与M13相比优势明显
| T7Select的优势 | 解释 |
| 是在细胞质中表达的裂解性噬菌体 | 与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。这一优点使更多的序列可能被展示。某些序列之所以不能在M13上展示，仅仅是因为M13颗粒组装所需蛋白必须穿膜分泌。这是M13的特征之一，造成M13文库的代表性有一定限制，而T7就无此缺陷。 |
| C-端融合 | 插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的插入子得以表达和展示。这在必须在N-端克隆的M13是无法进行的。N-端融合克隆cDNA时常会造成麻烦，因为poly(A)区( cDNA中为oligo d(T))常位于翻译终止密码子的下游。 |
| 载体克隆容量大 | T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。低拷贝Novagen T7载体克隆容量更是高达3 kbp |
| 插入片段稳定 | T7重组子很稳定，而M13重组子 尤其是>1 kb的很不稳定 |
| 洗提条件灵活 | M13稳定性尚可，但是洗提条件颇受限制，SDS、盐、离液剂等，都能造成不稳定。而T7在1% SDS，5 M NaCl，4 M尿素，2 M盐酸胍，10 mM EDTA, 100 mM DTT，pH 4-10等(参考inNovations 6相关文章)。而多数情况下，M13的用户被要求不能用酸洗(基本原则之一)。 洗提条件必须与所研究的相互作用一致。例如，筛查离子型相互作用时，应采用盐洗提；筛查疏水性相互作用即应该降低洗提试剂的极性。如果这些洗提试剂不能使用，筛查效果就会被相应降低。 |
| 生长迅速(小于3小时)，噬斑大 | 明显缩短富集过程，每轮亲和淘洗之间时间少，2天内即可完成标准淘洗 |
| 包装效率极高(>109 pfu/ug) | 操作很简便，只需将DNA加到抽提物中，放置并铺板。与将DNA导入宿主细胞相比(M13不能进行体外包装)，效率高得多，而后者常因电转化费时费力，且容易出错，效果不稳定。 |
| 克隆效率高 | M13要用电转化方能获得高效克隆，而T7Select制备大文库则容易得多 |
Novagen的人cDNA预制文库是怎么制备的？
Novagen的预制T7Select cDNA文库均以T7Select10-3b制备，材料是经Novagen的Straight A’s™ mRNA分离试剂盒两次纯化的mRNA。mRNA最长达8 kb以上，经反转录，用Novagen的OrientExpress™ Random Primer cDNA Kit (带甲基化dCTP)克隆。原始库的重组子为>1 x107 pfu，文库的滴度最低为1 x 1010 pfu。所有文库仅经一次包装和扩增。
哪一种Novagen的T7噬菌体载体(T7Select1-1，10-3，1-2或415-1)最适合我？
T7Select1-1和T7Select10-3载体适合用于构建cDNA文库和PCR克隆- 能确保产物均为同一阅读框。作为cDNA载体，由于是定向克隆，所生成的带正确阅读框的转录产物较之非定向克隆方法多1倍。如果采用非定向克隆策略，则获得按正确阅读框表达的多肽或蛋白的几率会下降一半，即为克隆总数的1/6 (1/3正确阅读框X ?正确方向)。
T7Select415-1适合用于构建多肽库。
T7Select1-2载体用于从单一cDNA克隆展示蛋白或多肽。因此，cDNA 插入子在T7Select1-2载体上可有3种阅读框供选择。
亲和淘洗有什么好处？
亲和淘洗用于检测有蛋白或多肽参与的相互作用非常有效。如果目的序列的配合基被纯化和组装，即可用多肽或蛋白库与之反应(通常在柱子或96孔板上进行)，检测其结合情况。“捕获”的完整噬菌体经洗提、扩增，再经2至3次这样的富集，即可在很短的时间内一次完成药物或纯化的受体与为数众多的多肽或蛋白的结合分析。采用这种方法进行配合基(如信号转导中间体区域)结合区作图也是可行的。
cDNA在lambda载体表达与T7Select亲和淘洗有什么不同？
确切地说，亲和淘洗是一种选择方法，而非仅仅只是一种筛选方法。亲和淘洗可以直接发现和“捕获”表达目的多肽或蛋白的噬菌体，这种富集操作较之传统的lambda噬菌体或质粒筛选优势十分显著。
为什么T7Select C-端融合很重要？
将目的序列克隆到T7Select载体基因10 的C-端可以使含有终止密码子的插入序列得以表达和展示。M13只能进行N-端融合，而N-端融合容易发生移码错误。
经过3-4轮亲和淘洗富集后，噬菌体的纯度能够达到多少？
每种目的产物的KD (亲和性)都不一样，用户可以参考T7Select产品操作手册TB178 (“亲和淘洗次数”部分)，经计算估计富集程度。T7Select阳性对照裂解物可作为参考指标，但仅供作为目的产物的参考。T7Select阳性对照裂解物可以作为标准参考，但不作为目标产物的直接判别依据。当T7Select阳性对照裂解物与没有插入片段的噬菌体(T7Select阴性对照裂解物)以1:106 -1:107 结合，同源阳性噬菌体经过3或4轮亲和淘洗即可在S-蛋白包被的ELISA板上富集。S-蛋白包被的ELISA孔结合活性约为108 -109 pfu，超过这个数值的噬菌体则不能被结合。
我已经做了3-4轮亲和淘洗富集，接下来该怎么办？
建议在经过3-4轮亲和淘洗后对几个噬菌体DNA克隆进行测序。最好对目的序列邻近的序列也进行分析，这有助于确定相关特征信息。阳性克隆可以亚克隆到合适的pET载体上表达、纯化及检测目的产物。
T7Select系统能表达足够的蛋白用于plaque lifts？
低拷贝表达通常难以用Western分析检测到；只有高拷贝表达的蛋白和多肽可以检测。
T7会侵染其它实验材料吗？
和所有噬菌体一样，T7也能感染其它宿主。但是，除了T7Select415-1以外，所有其它T7Select噬菌体载体的宿主必须是那些能够表达T7基因10 壳蛋白的菌株。因此噬菌体扩散的危险性被大大降低了。M13、lambda和其它T7噬菌体的操作同样有类似的考虑，T7仅能感染F- E.coli。
