多色微球液相芯片技术的原理及其应用

多色微球液相芯片是一个多功能的液相分析平台，其有机整合了有色微球、激光技术、应用流体学、快速信号处理和数据分析系统，故特异度和灵敏度较高。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析及受体与配体的识别分析等领域中。

一、原理及优势

1、原理

多色微球液相芯片技术的分析基础是由微小的聚苯乙烯粒子组成的微球。这种微球结合了两种不同颜色的荧光染料(红色和橙色)，当微球被635nm的激光照射后，能发射658nm和712nm的荧光。比较二者发射光的比率，最多能够区分100种不同的荧光微球。运用精密的流式细胞技术、数字信号处理器和先进的激光技术，根据事先确定的荧光发射比率，该仪器能鉴定出每一种不同颜色的微球。

在分析检测过程中，多色微球可通过羧基或者其他基团与不同的分析物质(抗原、抗体、寡核苷酸探针等)结合．加入检测样本充分混合，再和能与报告分子结合的第三种荧光染料(绿色荧光染料)相互作用。

微球被两柬激光照射，第一束激光激发微球本身的荧光，用于鉴别微球的种类；第二柬激光激发与被测物质结合的第三种荧光染料(绿色荧光染料)，通过检测荧光的强度进而对被测物质进行定量分析[1]。该技术是一种多重数据获取和分析平台，不仅能用于血清蛋白的定性和定量分析，通过结合各种特异性寡核苷酸捕获探针也可用于核酸的检测分析。

2、优势

（1）与ELISA比较该技术在各种应用中的检测结果与传统的ELISA基本一致，但有着ELISA无法比拟的优越性。

①多重性：一次可同时分析100种不同的因子[2,3]。而ELISA每次只能对1种因子进行单一分析；

②液相反应：反应过程中微球能在液相的条件下悬浮几个小时[4,5]，既增加了反应面积，又较ELISA更加接近分子反应的自然状态。而且液相的条件有利于抗原与抗体结合、核酸与核酸杂交、配体与受体结合等；

③节约时间：所有因子分析可在一次反应中同时进行，且一次分析不到3h[3,6]；而ELISA对1种因子的分析就需要几天时间。

④节约样品：每次检测所需血清量不超过3OuL[7]；

⑤节约人力资源：耗时短。

⑥敏感度高：敏感度为l.5ug／ml，而ELISA为3.0pg／ml[8]；

⑦动力学范围宽：动力学范围为0.006～6.8pg／ml，ELISA为0.06～1.7ug／ml[8]；

⑧特异度高：特异度明显高于ELISA[6]。

（2）与传统的固相芯片法比较[9]

首先是成本低，制备传统芯片所需的设备及分析软件非常昂贵，而多色微球液相芯片技术可节约经费；其次是效率高，传统芯片制备杂交所需时间约16h，而多色微球液相芯片整个过程只需约3h；最后是反应条件不同，多色微球液相芯片完全在液相中进行生物反应，使反应更接近于自然状态，而固相芯片只有一种分子处于游离状态可以自由移动。

二、应用

1、蛋白质检测

（1）免疫分析多色微球液相芯片技术最早应用于免疫分析中。Opalka等利用该技术同时定量检测人乳头瘤状病毒(HPV)6、l1、16、18型四种病毒颗粒上的中和表位抗体．它们在微球上结合了酵母表达的4种不同病毒样颗粒(VLPs)，再与藻红蛋白(PE)标记的、型特异性的单克隆抗体(Mabs)充分反应，使VLPs与MAb—PE充分结合，而样本中的型特异性的HPV—VLP抗体与VLPs亲和力比MAb—PE更高，从而抑制VLPs与MAb—PE的结合。因而报告分子MAb—PE的荧光信号强度与血清中的HPV—VLP抗体滴度成反比。可通过检测报告分子MAb—PE的平均荧光强度(MFI)进而对HPV6、l1、16、18型特异性的中性抗体进行定量检测。

Biagini等运用该技术分析了人炭疽毒素IgG抗体，将样本中加入已结合了保护性抗原（PA）IgG和致死性因子(LF)IgG的微球，使其与anti—PA—IgG和anti—LF-IgG反应，通过分析micr0sphere—PA—IgG(-LF)-anti-IgG—R—phycoerythrin的平均荧光强度(MFIs)，实现对患者血清中两种炭疽杆菌毒素的定量分析。

相应的研究还有对呼吸道合胞病毒和西尼罗河病毒以及与自身免疫性疾病有关的9种自身抗体(SS—A，SS—B，Sm，RNP，Scl-70，Jo-1，CENP-B，PribosomalanddsDNA抗体)进行定性和定量分析，并应用于临床诊断。但与ELISA检测一样，多色微球技术用于血清中抗原和抗体的检测时，也会受到血清中异常因子的影响，为此有的学者在该技术中没计了两种内对照，用于检验样本是否被正确加入和被检测的样本中是否含有干扰性的类风湿因子(RF)。

（2）可溶性蛋白分子或化学因子的检测该技术提供了一种高度敏感的多重分析平台，能同时对细胞因子或化学因子进行定性和定量检测。将每一种捕获性试剂结合至微球，与特异性的细胞因子或化学因子反应，通过检测每种因子的MFI，从而对每种细胞因子进行定性和定量检测Keyes等研究了化疗对肿瘤组织中血管生成细胞因子分泌的影响，他们将针对蛋白激酶CB抑制剂LY317615或肿瘤坏死因子-a(TNF—a)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-13(TGF-13)的抗体与微球结合，与样本混合置4C摇床过夜，再加入链霉亲和素一藻红蛋白(SA—PA)孵育15min，通过比较分析各种不同微球的MFI，从而对生长因子的分泌进行定性和定量分析。Jiang等运用该技术检测儿童轮状病毒感染时9种细胞因子(IL-1B、IL-2、1L-4、1L-6、IL-8、IL-10、IL-12、1FN-Y、TNF-a)的表达水平。

Jager等利用该技术对15种细胞因子(IL-1a、IL-1B、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-RP70、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、Y-干扰素、肿瘤坏死因子)进行了定性和定量分析。Nguyen等利用该技术检测分析在血清中或阴道分泌物中的人乳头瘤状病毒(HPV)特异性抗体，证实子宫癌患者中的HPV特异性lgA反应下调。该技术不仅限于细胞因子的检测，任何可溶的化学因子都可用该法进行定性和定量分析。

2、核酸检测该技术用于核酸分析的原理是通过一些化学反应将针对于靶基因的捕获性寡核苷酸探针与微球结合，然后与5’端用生物素标记的目的基因杂交，再在反应体系中加入SA—PA共同孵育，SA—PA与生物素标记的目的基因结合，通过PA的荧光强度决定微球表面捕获性寡核苷酸探针与目的基因结合的量，最后通过各种软件检测分析微球的MFI，实现对目的基因的定性和定量检测。

YangLi等设计了25个碱基的寡核苷酸序列做捕获性探针，以人类基因NTSR作阴性对照，运用该技术对样本中待测核酸的有无及多少做出相应评价。Smith等运用该技术对HIV、HCV、HSV的病毒核酸进行定性和定量分析。该法不仅能同时用于RNA和DNA病毒的检测，还能进行DNA的序列分析。

Cowan等采用该技术对肺结核(TB)杆菌进行了基因分型分析；Diaz等则对病原体的种类和感染程度进行了分析。由于多色微球液相芯片技术具有简单快速、敏感度好、特异性高、节省样本量、缩短分析时间、节约劳动力、检费用低，以及多通路、高通量和实时数据分析等优点，因而在免疫分析、核酸研究、酶学分析和受体与配体的识别分析等研究中有很大的应用价值，随着研究的不断深入和配套试剂的不断研发成功，该技术可用于临床诊断、基础研究、高通量药物筛选、环境监测等。

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