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多色流式细胞术检测 B 细胞表型

相关实验:B 细胞的表型检测

最新修订时间:

简介

根据 CD27 的表达与否可将 B 细胞分为初始性 B 细胞和记忆性 B 细胞,初始性 B 细胞不表达 CD27,其 Ig 的 V 区基因未发生高频突变;而记忆性 B 细胞高表达 CD27,Ig 的 V 区基因已经发生高频突变。记忆性 B 细胞的增殖和分化速率明显高于初始性 B 细胞,表面分子 CD40、TLR(如 TLR6、TLR7、TLR9 和 TLR10 等)和细胞因子受体的表达也高于初始性 B 细胞。

原理

B 细胞表型检测基本原理是利用 B 细胞表面膜分子,包括细胞表面分化抗原和模型免疫球蛋白(smlg),在分化的不同阶段和不同的定居位置,B 细胞表达的表面分子不尽相同,因此可以根据表面分子的不同来判断 B 细胞分化的阶段和功能状态。

材料与仪器

试剂:

(1)NP-KLH

(2)Ribi 佐剂

(3)0.14 mol/L NH,Cl、Hanks 液

(4)染色缓冲液(1xPBS+0.1% BSA+0.05% 叠氮钠)

(5)布雷菲德菌素 A(Brefeldin A,BFA)或莫能霉素(Monensin)

(6)mAb

仪器:

(1)流式细胞仪

(2)离心机

(3)滤网、注射器等

步骤

B 细胞表型检测的基本过程可分为以下几步(以小鼠为例,主要阐述应用多色流式细胞术检测 B 细胞的表面分子,分析 B 细胞的表型和功能,鉴定 B 细胞的分化不同阶段以及记忆性 B 细胞的亚群。):

(1)制备检测 B 细胞所需的单个核细胞悬液


1)免疫小鼠:


①使用 400 μg NP-KLH 溶于 Ribi 佐剂,腹腔免疫 6~10 周龄 C57BL/6J 小鼠;


②初次注射至少 6 周后,再次用同样的方法免疫该小鼠;


③可在加强免疫 1 周后处死小鼠,检测 B 细胞。


2)制备细胞悬液:


颈椎脱臼法处死小鼠,取脾脏,滤网碾磨后裂解红细胞,用 Hanks 液重悬,调整细胞浓度为 2x106/ml。


(2)体外培养细胞


选择合适的刺激剂体外刺激细胞,特异性活化 B 细胞;如果要检测细胞因子的表达,同时加入阻断剂 BFA(检测 IL-10 时,用莫能霉素)。


(3)荧光抗体标记细胞


1)用染色缓冲液洗涤细胞,重悬细胞浓度为 2x10/ml,加入适量浓度的生物素标记 mAb,4 ℃ 冰箱育 30 分钟。

2)孵育结束后,用染色缓冲液洗涤细胞 2 遍,重悬细胞于含有适量浓度的链霉亲和素(streptavidin)-Cy7APC 的标记液中,4 ℃ 冰箱孵育 15 分钟。

3)孵育结束后,用染色缓冲液洗涤细胞 2 遍,重悬于 100 μl 含有 2 μg/ml PI(用于排除死细胞)的染色缓冲液中,冰浴不超过 15 分钟准备上机检测。

4)上流式细胞仪获取数据及分析数据。

来源:丁香实验

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