简介
根据 CD27 的表达与否可将 B 细胞分为初始性 B 细胞和记忆性 B 细胞，初始性 B 细胞不表达 CD27，其 Ig 的 V 区基因未发生高频突变；而记忆性 B 细胞高表达 CD27，Ig 的 V 区基因已经发生高频突变。记忆性 B 细胞的增殖和分化速率明显高于初始性 B 细胞，表面分子 CD40、TLR（如 TLR6、TLR7、TLR9 和 TLR10 等）和细胞因子受体的表达也高于初始性 B 细胞。
原理
B 细胞表型检测基本原理是利用 B 细胞表面膜分子，包括细胞表面分化抗原和模型免疫球蛋白（smlg），在分化的不同阶段和不同的定居位置，B 细胞表达的表面分子不尽相同，因此可以根据表面分子的不同来判断 B 细胞分化的阶段和功能状态。
材料与仪器
试剂：
（1）NP-KLH
（2）Ribi 佐剂
（3）0.14 mol/L NH，Cl、Hanks 液
（4）染色缓冲液（1xPBS＋0.1％ BSA＋0.05％ 叠氮钠）
（5）布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，BFA）或莫能霉素（Monensin）
（6）mAb
仪器：
（1）流式细胞仪
（2）离心机
（3）滤网、注射器等
步骤
B 细胞表型检测的基本过程可分为以下几步（以小鼠为例，主要阐述应用多色流式细胞术检测 B 细胞的表面分子，分析 B 细胞的表型和功能，鉴定 B 细胞的分化不同阶段以及记忆性 B 细胞的亚群。）：
（1）制备检测 B 细胞所需的单个核细胞悬液
1）免疫小鼠：
①使用 400 μg NP-KLH 溶于 Ribi 佐剂，腹腔免疫 6～10 周龄 C57BL/6J 小鼠；
②初次注射至少 6 周后，再次用同样的方法免疫该小鼠；
③可在加强免疫 1 周后处死小鼠，检测 B 细胞。
2）制备细胞悬液：
颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，滤网碾磨后裂解红细胞，用 Hanks 液重悬，调整细胞浓度为 2x106/ml。
（2）体外培养细胞
选择合适的刺激剂体外刺激细胞，特异性活化 B 细胞；如果要检测细胞因子的表达，同时加入阻断剂 BFA（检测 IL-10 时，用莫能霉素）。
（3）荧光抗体标记细胞
1）用染色缓冲液洗涤细胞，重悬细胞浓度为 2x10/ml，加入适量浓度的生物素标记 mAb，4 ℃ 冰箱育 30 分钟。
2）孵育结束后，用染色缓冲液洗涤细胞 2 遍，重悬细胞于含有适量浓度的链霉亲和素（streptavidin）-Cy7APC 的标记液中，4 ℃ 冰箱孵育 15 分钟。
3）孵育结束后，用染色缓冲液洗涤细胞 2 遍，重悬于 100 μl 含有 2 μg/ml PI（用于排除死细胞）的染色缓冲液中，冰浴不超过 15 分钟准备上机检测。
4）上流式细胞仪获取数据及分析数据。
来源：丁香实验
