摘要
在免疫学检测中，酶标板的检测精准性和保证酶标板精准性的浓度范围，是决定使用哪种酶标板品牌的非常重要因素。本实验采用商业化的ELISA实验方法来分析比较11种不同品牌的酶标板的精准性和线性范围。实验证明在所有测试的酶标板中，Nunc MaxiSorp酶标板具有最广的线性范围（4-2000 pg待测蛋白/mL ）。MaxiSorp酶标板也显示出了良好的重复性，另外100%的MaxiSorp酶标板的R2 超过0.99，因此它在所有测试的不同品牌的酶标板中具有最精确的结果。
缩写
BSA：牛血清白蛋白
ELISA：酶联免疫吸附测定
HRP：辣根过氧化物酶
O.D.：吸光值
PBS：磷酸盐缓冲液
TNF-alpha：人肿瘤坏死因子a
引言
在定量实验中例如酶联免疫吸附测定（ELISA），不仅了解待测试剂的最小浓度是非常重要的，而且酶标板的精准性及保持测试精准性的浓度范围也同样重要。酶联免疫吸附测定（ELISA）中常使用一次性多孔板，而聚苯乙烯板的特性可能改变试剂与固象部分的结合方式。
这也反过来影响酶标板在不同反应物浓度时的精准性。保证酶标板准确度的浓度范围（线性范围）和线性曲线的重复性，是客户选择酶标板品牌着重考虑的因素。下面的酶联免疫吸附测定（ELISA）实验中，我们考察了Nunc Maxisorp和其它竞争品牌酶标板的准确性和线性范围。
实验方法
用商业化ELISA试剂盒中的稀释液来准备包被试剂：将0.1ml的捕获抗体溶液（稀释至4 μg/mL）加入酶标板的每孔中，密封酶标板，室温下放置过夜。重复洗酶标板3次，每个孔中加入0.3 mL封闭液（10 g/L 溶于PBS的牛血清白蛋白溶液），抚育一小时，重复上述冲洗步骤。用稀释液将人肿瘤坏死因子a以1：2梯度稀释，浓度从2000 pg/mL到2 pg/mL。
灵敏度测试用来考察每个品牌的最小可检测浓度。人肿瘤坏死因子a浓度分布详见表2。加0.1 mL的人肿瘤坏死因子a至每个孔中，室温下抚育2小时。重复上述冲洗步骤，加0.1mL抗体（稀释到250 ng/mL）至每个孔中，室温下抚育2小时。
重复上述冲洗步骤，加入0.1 mL的辣根过氧化氢酶-链霉亲和素溶液（1:200稀释）至每孔中，室温下抚育20分钟。经过最后一次冲洗后，每孔加入0.1mL的显色剂，反应20分钟后立即加入0.05mL的终止液。要精确控制显色反应时间，以保持每个酶标板的一致性。
用分光光度计读取每块酶标板在波长492nm下的吸光值，间隔5nm，100ms延时，300ms测试时间。检测阈值的计算方式为整板的空白孔（不加人肿瘤坏死因子a）的平均OD值加上两倍的标准偏差。以检测到超过阈值吸光度所对应的最小抗原浓度来评价酶标板的灵敏度。
通过线性范围测定来确定每块微孔板保持测量精准性的浓度范围。按以上步骤进行实验，所用的酶标板检测结果如表3所示，每一纵栏的吸光值（吸光值=测得的吸光值-空白孔吸光值），取重复孔平均值作为每板的数值。用Excel制作对数坐标的剂量-效应曲线，并计算出的R2，以此来评价每块板的线性结果。
表1.酶标板厂家及型号
表2.灵敏度测试中的人肿瘤坏死因子a浓度分布(pg/mL)
R2表示溶液中的实际蛋白质浓度与检测到的吸光值的相关性，或者说酶标板的精确性，1表示完全吻合。每块酶标板的灵敏度测试中的最小浓度作为线性范围的下限。线性范围的上限则选满足相关系数R2大于0.98前提下浓度中的最大值。每个品牌都选取三块酶标板做重复实验，测得的数值转化成对数值且取每种类型的酶标板的平均值。然后这些数值再被转换成算数值（平均上限=e的对数平均）来得到每个厂家酶标板的线性范围上限。
另外的9种酶标板（不同品牌，其中8个为来自竞争对手A的同一系列）在不同抗原浓度下得到的实验数据点，被标绘成线性图，但是这个范围仅仅覆盖了ELISA试剂盒厂家提供的浓度范围（16-1000 pg/mL)。综合考虑线性范围和R2值，来判断各个品牌酶标板的精准性。
结果和讨论
通过计算每个品牌酶标板的线性范围平均下限来评价其灵敏度。与其它竞争品牌相比，Nunc MaxiSorp酶标板具有最低的线性范围下限为4 pg/ mL，即灵敏度很高。表4给出了一个Nunc MaxiSorp酶标板的所有吸光值（吸光值=测得的吸光值-空白孔的吸光值）。表格中每个浓度的平均值对应的点图见图1。所有平均值的线性回归系数R2为0.9876（4-2000 pg/mL)。
所以这个酶标板的线性范围的上限就是2000 pg/mL。三种Nunc MaxiSorp酶标板的平均值都为2000 pg/mL，在所有被测试的酶标板中是最高的。表5的第3列显示了所有品牌的酶标板的线性范围的上限。
图1. 表格4数据对应的数值和回归线，其中表格4显示了各个不同浓度的平均值。对于所有标绘的点，计算得到的R2值为0.9876。
表3.线性范围测试中，人肿瘤坏死因子a的浓度分布(pg/mL)
表4. 其中一块Nunc MaxiSorp酶标板的吸光值，已经过空白孔的校正（测试的吸光值-空白孔的平均吸光值），空白孔的平均吸光值为0.112。
表5.各厂家酶标板的实验结果总结，在R2＞0.98的情况下，Nunc MaxiSorp酶标板有最大的平均浓度，为2000 pg/mL。最大浓度数值可参见表4及图1，最右边一列中对应不同R2值的各个厂家酶标板百分比数量，以剂量-效应曲线为基础计算的，浓度范围在16-1000 pg/mL。
线性范围测试中得到的R2值（局限于16-1000 pg/mL）与额外测试每个品牌的酶标板的结果相结合。三种条件下测试得到的酶标板的百分比被分为三类：R2＞0.99，0.98＜R2＜0.99，R2＜0.98，所有酶标板的实验结果见表5。计量反应曲线的R2＞0.99对应的酶标板的百分比越高，说明该品牌的酶标板的准确性越高。100%的MaxiSorp酶标板的R2 超过0.99,因此相比于其它品牌的酶标板，它具有非常高的准确性。
结论
在所有测试的酶标板中，Nunc MaxiSorp酶标板具有最高的线性范围的上限，以及最广的线性范围（4-2000 pg/mL ）。100%的MaxiSorp酶标板的R2 超过0.99，因此它在所有测试品牌中具有最好的线性（在整个浓度范围内）。良好的线性也表明，在实验条件下，MaxiSorp酶标板具有很高的准确性。重复性测试表明，在酶联免疫吸附测定中，准确性是选择酶标板的重要考虑因素。因为酶标板越准确地反映出抗原浓度，实验结果就越准确。MaxiSorp酶标板在很宽的抗原浓度范围内能保证很高的准确性，因此是实验科研的理想选择。
