盐析法纯化免疫球蛋白

(一) 原理

蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。

同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

(二) 主要材料

1. 试剂：

(1) 正常人混合血清；灭菌生理盐水。

(2) 饱和硫酸铵溶液的配制：称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。

(3) 萘氏试剂配制： 称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。

(4) 0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制。

　　贮存液：

　　A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；

　　B液：0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；

　　应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。

(5) 0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer PB）配制：
　　将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。

(6) 20%磺基水杨酸。

2. 器材：

普通冰箱、离心机、电磁搅拌器、751桮型紫外分光光度计、扭力天平、粗天平。

透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸（PH5.5～9.0）、眼科镊子、小剪刀。

烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。

(三) 盐析的操作步骤

1．取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50%饱和（NH₄）₂SO₄]（蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。加入（NH₄）₂SO₄时要先将其磨成粉末，再缓慢地边搅拌边加入）。
　　　　　　　　　　　　↓4℃，3小时以上，使其充分沉淀
　　2．离心（3000rpm），20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。
　　3．再逐滴加饱和硫酸铵X/2ml
　　　　　　　　　　　　↓置4℃，3小时以上［此时（NH₄）₂SO₄的饱和度为33%）］
　　4．重复上述第二步过程数次。将末次离心后所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至Xml装入透析袋。
　　　　　　　　　　　　│对PBS充分透析、除盐换液3次，
　　　　　　　　　　　　↓至萘氏试剂测透析外液为无黄色
　　将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。

方法如下： 
　　蛋白含量（mg/ml）=（1.45×OD280nm-0.74×OD260nm）×样品稀释度。
　　注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。

(四) 影响盐析的因素

1. 蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。

2. 离子强度：各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50%时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33%时γ球蛋白析出。

3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。

4. PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。

5. 温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。

6. 蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。