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RT-PCR引物设计原则和方法

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在NCBI上搜索到该基因,找到该基因的mRNA,在CDS选项中,找到编码区所在位置,在下面的origin中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

打开Primer Premier5,点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口,Copy目的序列在输入框内(选择As),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer,进入引物窗口。

此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项,点击Search按钮,进入引物搜索框,选择“PCR primers”,“Pairs”,设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面,可以设定相应参数。一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为100~200bp的产物电泳跑得较散,所以可以选择300~500bp。

点击OK,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口”中,显示出该引物的综合情况,包括上游引物和下游引物的序列和位置,引物的各种信息等。

对于引物的序列,可以简单查看一下,避免出现下列情况:3’端不要以A结尾,最好是G或者C,T也可以;3’不要出现连续的3个碱基相连的情况,比如GGG或 CCC,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括:Tm应该在55~70度之间,GC%应该在45%~55%间,上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多,大概在2度以下较好。

该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色,表示存在该二级结构,点击该红色按钮,即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好。

但有时很难找到各个条件都满足的引物,所以要求可以适当放宽,比如引物存在错配的话,可以就具体情况考察该错配的效率如何,是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成,Oligo自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5。

在Primer5窗口中,若觉得某一对引物合适,可以在搜索结果窗口中,点击该引物,然后在菜单栏,选择File-Print-Current pair,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pdf文档,里面有该引物的详细信息。

在Oligo软件界面,File菜单下,选择Open,定位到目的cDNA序列(在primer中,该序列已经被保存为Seq文件),会跳出来两个窗口,分别为Internal Stability(Delta G)窗口和Tm窗口。

在Tm窗口中,点击最左下角的按钮,会出来引物定位对话框,输入候选的上游引物序列位置(Primer5已经给出)即可,而引物长度可以通过点击Change-Current oligo length来改变。定位后,点击Tm窗口的Upper按钮,确定上游引物,同样方法定位下游引物位置,点击Lower按钮,确定下游引物。引物确定后,即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。

Analyze中,第一项为Key info,点击Selected primers,会给出两条引物的概括性信息,其中包括引物的Tm值,此值Oligo是采用nearest neighbor method计算,会比Primer5中引物的Tm值略高,此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G。3’端的Delta G过高,会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小一些,最好不要超过9。

Analyze中第二项为Duplex Formation,即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况,还可以选择Upper/Lower,即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素,因此应该避免设计的引物存在二聚体,至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的,即其Delta G值应该偏低,一般不要使其超过4.5kcal/mol,结合碱基对不要超过3个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。

Analyze中第三项为Hairpin Formation,即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物,同样,Delta G值不要超过4.5kcal/mol,碱基对不要超过3个。

Analyze中第四项为Composition and Tm,会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm值。上下游引物的GC%需要控制在40%~60%,而且上下游引物之间的GC%不要相差太大。Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来,包括nearest neighbor method、%GC method和2(A+T)+4(G+C)method,最后一种应该是Primer5所采用的方法,Tm值可以控制在50~70度之间。

第五项为False Priming Sites,即错误引发位点,在Primer5中虽然也有False priming分析,但不如oligo详细,并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率,一般的原则要使错误引发效率在100以下,当然有时候正确位点的引发效率很高的话,比如达到400~500,错误引发效率超过100幅度若不大的话,也可以接受。

Analyze中,有参考价值的最后一项是“PCR”,在此窗口中,是基于此对引物的PCR反应Summary,并且给出了此反应的最佳退火温度,另外,提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在,并且Delta G值偏大的话,Oligo在最后的评价中会注明,若没有注明此项,表明二级结构能值较小,基本可以接受。

引物评价完毕后,可以选择File-Print,打印为PDF文件保存,文件中将会包括所有Oligo软件中已经打开的窗口所包括的信息,多达数页。因此,打印前最好关掉Tm窗口和Delta G窗口,可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(若存在可疑的异常的话)和PCR窗口。

引物确定后,对于上游和下游引物分别进行Blast分析,一般来说,多少都会找到一些其他基因的同源序列,此时,可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析,只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。

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