鼻腔给药的动物模型与鼻黏膜毒性

一、动物模型

（一）研究药物吸收的动物模型

几种体内动物模型被广泛的应用于研究药物的鼻腔吸收，其中应用最为普遍的是大鼠模型。通常将大鼠麻醉后切开颈部皮肤，做一食管插管直至鼻腔后部，封闭鼻腭通道，防止药液从口腔流失。将药液输入鼻腔并反复循环，计算试验池中药物浓度的下降。即为被吸收的药物量。

家兔是另一种被广泛应用于药物鼻腔吸收试验的动物模型。另外几种应用较多的试验动物有绵羊、狗、猴等。对于药物动力学和处方筛选的研究来说，大鼠、绵羊和狗是较为适宜的模型动物。但是，不同种属间的动物往往存在着吸收差异。常用的动物试验方法有以下几种：

1. 非手术给药法本通过装置直接将适量药物或药液给入实验动物的鼻腔内，然后将动物取仰卧位，从适宜部位取血，该法简便易操作，适用于鼻腔给药生物利用度的研究。

2.手术给药法在动物颈部做一气管插管，另通过一聚乙烯管从食道插人鼻腔后部，封闭鼻腭，从适宜部位取血。

3.鼻腔循环灌流法外科手术法同上，使用蠕动泵使药液循环通过测定残余药物浓度，计算吸收量。

4.同位素标记法和染料标记法用适宜方法给药，用γ一闪烁照相机或鼻腔镜观察药物分布。此类方法是用于在体研究药物在鼻黏膜表面的滞留时间。本法最能说明吸收过程，但设备昂贵，且标记法适用性不广，难以普遍开展。

（二）研究鼻纤毛毒性的动物模型

常有两种方法：

1、离体法

可用蛙和蟾蜍上腭的新鲜黏膜进行。分取两小块，一块供试验药使用，另一块以生理氯化钠溶液作为对照，以对照作为100，求出试验块纤毛的运动持续时间相对于对照块的百分率即可。

2、在体法

即对活体动物进行纤毛毒性研究。

总之，一个药物是否可以设计为鼻腔给药制剂需通过一系列研究后才能做出结论，其中包括纤毛毒性、体外透膜试验；动物在体吸收、人体生物利用度研究等。

二、鼻黏膜毒性

（一）鼻黏膜毒性作用的评价方法

1、评价药物对纤毛清除作用的影晌

纤毛清除作用是纤毛及其黏液层机械作用的结果，是机体抵御外界的一道屏障。鼻腔给药后不应对纤毛清除作用造成不良影响。评价方法有多种，有些将黏膜纤毛系统作为一整体来研究，有些则研究其主要组成，纤毛运动及黏液转运功能。

(1)测定纤毛摇动频率（ciliary beat frequency，CBF） 体外测定CBF最常用的技术为透射光电技术。重视性好，灵敏度高。此外，还有反射光电技术、摄像或视频技术。体外测定常用的离体组织为人体黏膜组织。无需麻醉从次鼻甲或前鼻壁都可刷下黏膜纤毛组织。

鸡胚胎气管黏膜组织由于材料易得、费用少，也是常用的动物模型，其它还有大鼠、兔或豚鼠的黏膜组织。药物及辅料对CBF的影响有较大的物种差异。如止咳药Chinoin-170对离体大鼠气管CBF有抑制作用，对人体黏膜纤毛却没有任何影响。

某些防腐剂对这两种组织的作用也存在类似差异。许多研究表明药物及辅料对鸡胚胎气管和人黏膜组织CBF的作用相似。测定体内CBF可选择兔，用光电技术进行，但期间涉及的麻醉会对测定结果有影响，手术也可能损伤黏膜。有人提出用反射光电技术，可不经麻醉或手术直接测定人体CBF。

(2)测定纤毛持续运动时间：常用光学显微镜观察纤毛持续运动时间。动物模型主要有鸡胚胎气管黏膜纤毛和蛙或蟾蜍上腭黏膜纤毛，均与哺乳动物鼻黏膜纤毛相似。体外法操作如下：取带纤毛的黏膜上皮于载玻片上，滴加药液，光学显微镜观察，记录从给药开始至纤毛运动停止所持续的时间。洗净药液，继续观察纤毛运动是否恢复，判断药物对纤毛的静止作用是否可逆。体外法不足之处是：

①难以正确评价混悬型或粘稠药物制剂的纤毛毒性。

②分离黏膜时会破坏黏液层，忽略了黏液层对纤毛的保护作用。

体内法可弥补不足：将蛙或蟾蜍固定，于上腭黏膜滴加药液，接触一段时间后洗去，分离黏膜观察纤毛运动情况。此实验条件更接近实际给药情况，结果更可靠。与测定CBF相比，记录纤毛持续运动时间带有一定主观性，不如前者精确。但显微镜观察较直观，可同时观察纤毛数量、脱落情况、黏膜完整性等形态学变化。

(3)测定黏膜纤毛转运能力，蛙上腭是常用的体外模型。可用立体显微镜测定石墨微粒在黏膜表面移动一定距离所需时间，计算转运速率。动物体内黏膜纤毛转运能力的研究采用荧光球、荧光乳胶微粒为清除标记物。鼻腔给药后一定时间给予标记物，定时从鼻咽部收集被清除的标记物，并绘制时间荧光强度曲线，与给药前进行比较，可考察药物或制剂对同一动物纤毛清除作用的长期影响。评价人体内黏膜纤毛转运能力可选用多种标记物，包括放射性物质、染料，此外，较常用的是糖精。糖精法简单易行，对人体无害，被广泛采用。鼻腔给予糖精，当其被清除至鼻咽部时志愿者即可感觉出甜味。这段时间（T）的长短可反映黏膜纤毛转运速度的快慢。比较用药前后的T值，即能评价药物对纤毛清除作用的影响情况。人体糖精实验的结果个体差异很大，必须作自身对照。

2、评价黏膜形态的变化，考察给药后黏膜组织结构及表面纤毛形态的变化是鼻黏膜毒性最直接的评价方法。大鼠、免或狗可使用光学或电子显微镜观察。以大鼠为例，光学显微镜观察方法为：大鼠麻醉，单侧鼻腔给药后处死，取中隔黏膜染色，观察黏膜组织结构的变化，包括给药侧中隔黏膜上皮的厚度、黏液释放量、上皮细胞排列的有序程度、上皮细胞核的大小及规则程度等等。扫描电子显微镜主要考察黏膜表面纤毛形态的改变，包括数量、排列情况等，相对较易掌握。共聚焦激光扫描显微镜是一种新兴的技术，可观察生物标本的三维图象，已被用来确定药物通过鼻黏膜转运的通道，研究促进剂对药物转运和细胞形态的影响。人体的鼻黏膜形态学评价可用鼻内窥镜观察。上述几种形态学评价均适用于单次或多次给药后鼻黏膜毒性的考察。

3、溶血实验考察药物对生物膜的作用 鼻黏膜组织受损的原因之一是药物或辅料对细胞膜有破坏作用，因此通过考察药物或辅料对生物膜的作用可间接评价鼻黏膜毒性。常用的天然生物膜是红细胞膜，通过溶血实验来考察。达到完全溶血所需浓度越小，膜破坏作用就越大。将二棕榈酰磷脂胆碱（DDPC）分散至水中可制成模拟生物膜，常温下呈凝胶状，用差示扫描量热仪能测定DDPC双层结构的晶格转化温度。吸收促进剂与DDPC作用后会使其晶格转化温度发生改变，由此可定量考察不同促进剂对DDPC膜的破坏作用。

4、用生化指标进行评价鼻黏膜受损时会释放出膜蛋白及酶，通过测定一些特定蛋白和酶的释放量，即可检测黏膜受损的情况。通常用大鼠在体鼻腔灌流技术进行，将含药溶液通过鼻腔循环灌流，灌流一定时间后收集循环液，测定其中蛋白质和酶的总量，或特定酶的量。有人认为此模型与实际给药条件相差太大，包括灌流时间过长；灌流时会造成对黏液层的破坏；灌流体积远大于实际给药体积。因此建议使用体内法：大鼠鼻腔给药后15min，通过食管插管，用生理盐水冲洗鼻腔并收集、测定冲洗液中酶和蛋白质的量。以上四种评价鼻黏膜毒性的方法各有侧重点。黏膜形态考察最直观，但方法复杂不适于大量筛选，可用于处方确定后，评价其急性、亚急性及慢性鼻黏膜毒性。评价药物对纤毛清除作用影响的方法相对较简单，适用于处方筛选阶段。药物或辅料的纤毛毒性与其对鼻黏膜组织结构和形态的影响有很好的相关性，能较好的预测药物及辅料的鼻黏膜毒性。溶血实验简单易行，可筛选的药物较蛙上腭模型更多。在蛙冬眠的季节可考虑以此法代替，缺点是无法考察纤毛毒性是否可逆。生化评价法虽然操作繁琐不适于大量筛选，但在评价药物或辅料对膜破坏作用的同时，可对药物透膜吸收机理进行考察。许多实验表明，用CBF、黏膜形态、溶血实验、生化评价法为指标评价吸收促进剂的鼻黏膜毒性时，各项结果相一致。在诸多方法中，体外法往往简单易行，但其实验条件与实际给药情况有一定差距，在预测药物和辅料的鼻黏膜毒性时，需结合体内法的实验结果。

(二)药物及辅料对鼻黏膜的毒性作用

鼻黏膜给药的缺点是制剂对鼻黏膜的刺激，主要是纤毛毒性作用，包括药物、附加剂、吸收促进剂和防腐剂的刺激。

1、药物的鼻黏膜毒性，研究发现，大分子天然生物合成药物对鼻纤毛的毒性小，如胰岛素对离体大鼠黏膜的纤毛运动无抑制作用，也不影响鸡胚胎气管CBF。鲑降钙素对蛙上腭黏膜纤毛转运能力、鸡胚胎气管CBF均无影响，但干扰素是例外。小分子化学合成药物对纤毛运动的影响较为普遍。1%普萘洛尔可造成纤毛运动不可逆的停止，纤毛大量脱落，持续运动时间为零。10%普罗帕酮混悬液大鼠鼻腔给药连续一周、黏膜表面受损，纤毛结构不清。

药物对鼻纤毛影响有三种情况：

①呈不可逆性的纤毛毒性，如布比卡因等。
　　②呈可逆性的纤毛毒性，如抗组胺剂、抗微生物类药等。
　　③刺激纤毛活动的药物。对容易引起不可逆性的纤毛毒性的药物，不宜长期鼻腔给药。

2、吸收促进剂的鼻黏膜毒性

某些黏膜渗透性差的药物．如蛋白多肽类、同时使用吸收促进剂时其吸收效率会大大提高。但吸收促进剂普遍存在黏膜毒性问题。0.3%的牛磺褐霉素钠（STDHF）可使离体人鼻黏膜纤毛运动不可逆的静止。同浓度的聚氧乙烯月挂醚-9（L-9）和去氧胆酸钠（SDC）能迅速引起纤毛运动不可逆的静止，相比之下甘氨胆酸钠（GC）和牛磺胆酸钠（TC）对离体人鼻黏膜纤毛的影响则温和得多。以蛙上腭模型考察促进剂对黏膜纤毛转运能力的影响时发现：1%溶血胆碱磷脂（LPC）、1%L-9，1%SDC，1%STDHF均完全抑制纤毛转运。1%GC和1%DDPC则几乎无影响。许多研究调查了吸收促进剂对动物鼻黏膜组织的形态学影响。1% SDC、1%L-9。1%STDHF和1%LPC均引起严重的黏膜上皮损伤。含1.5%GC的多肽类人体鼻用制剂，单次或多次用药后均有鼻腔刺激性。临床研究表明，人体对含0.8%～3.0%STDHF的鼻用制剂耐受性很差。但也有人报道，STDHF虽然能引起不适，鼻黏膜形态观察却未发现毒性。以SDC为促进剂的胰岛素鼻用制剂，在临床研究阶段也发现使用后普遍存在鼻腔烧灼感和流泪现象。环糊精在鼻腔制剂中可作脂溶性药物的增溶剂，也可作为蛋白多肽类药物的吸收促进剂。2%～4%DM-β-CD对离体CBF作用温和。人体实验表明，志愿者对DM-β-CD的鼻用制剂耐受性很好。多种促进剂的鼻黏膜毒性由小到大的排列顺序为：DM-β-CD＜GC＜STDHF＜LPC= L-9=SDC。

3、其他制剂成分的鼻黏膜毒性

局部或全身作用的液体鼻腔给药系统往往含有防腐剂。这些防腐剂对纤毛运动的影响已被广泛研究，但不同模型和方法所得到的结果却并不一致。许多体外实验显示洁尔灭对纤毛运动有影响，但动物体内实验及人体应用却未发现有副作用。长期使用含0.01%～0.02%洁尔灭的鼻用制剂，不会引起大鼠或猴鼻黏膜形态改变。人体短期或长期使用也不会导致鼻纤毛清除功能的改变或黏膜损伤。尼泊金酯类有较大的纤毛毒性作用。对于蛋白多肽类鼻腔给药系统，在设计处方时往往会加入酶抑制剂。某些酶抑制剂如杆菌肽、抑肽酶有纤毛毒性。

(三)降低鼻黏膜毒性的方法

药物的鼻黏膜毒性限制了其鼻腔给药制剂的研究。普萘洛尔口服具有严重的首过效应，鼻腔给药后生物利用度可提高至100%。但其严重的纤毛毒性，导致有关鼻腔给药制剂的研究无法继续。吸收促进剂是鼻腔给药制剂中极其重要的一类附加剂，尤其对于大分子多肽类药物。促进剂的促吸收作用与膜损伤作用有直接的关系，因此解决鼻黏膜毒性的难点在于：改善鼻黏膜毒性的同时必须保留鼻腔给药的原有优点。目前解决药物和促进剂毒性问题的研究报道较少，主要解决方法有：

1、药物缓释法

药物和促进剂的纤毛毒性具有一个重要的特点即浓度相关性。基于这一点，蒋新国等人以普奈洛尔为模型药物，将其制成微球剂、复合乳剂和环糊精包合物以降低普奈洛尔的鼻纤毛毒性。微球剂具有缓释作用，药物可缓慢持续地被释放，释放的药物又不断地被粘膜吸收，使局部游离的药物浓度很低。

2、混合胶团法

胆盐类的鼻黏膜毒性限制了它在鼻腔制剂中的应用。有人选用甘氨胆酸盐/亚油酸作为蛋白多肽类鼻腔给药系统的吸收促进剂，进行大鼠体内吸收研究。发现其促吸收作用比单用胆盐要好，给药5h后混合胶团引起的黏膜形态学改变较为温和。Karali等用油酸、单油酸甘油酯和牛磺胆酸钠制成肾素抑制剂乳剂。大鼠鼻腔给药，绝对生物利用度达20%左右。给药4h后光学及电子显微镜检查黏膜形态，均未发现明显异常。

3、环糊精（CD）包合法

CD在鼻腔给药中可直接或间接促进药物吸收，也可降低一些吸收促进剂及防腐剂的黏膜毒性。促进剂L-9，GDC，LPC或防腐剂洁尔灭对DDPC膜有破坏作用，使其晶格转化温度发生改变，当加入α-CD， HP-β-CD，γ-CD时，DDPC膜的晶格转化温度可回复到初始值，说明这些环糊精可保护生物膜不受促进剂或腐剂的破坏。 大鼠体内吸收实验表明，加入环糊精后，只有L-9的促吸收作用未发生改变，GDC、LPC均受到了不同程度的影响。给药后4h光学显微镜观察中膈两侧的黏膜形态。0.9%L-9和0.9%GDC都造成了鼻黏膜上皮的损伤，细胞破裂，继而引起上皮变薄，某些部位上皮完全脱落并伴有大量黏液。当同浓度的L-9加人1：4比例的HP-β-CD后其对黏膜的作用与环糊精相似，上皮表面无破裂细胞，但上皮细胞排列紊乱，有较多黏液，上皮厚度变薄。GDC加入1：2的γ-CD后黏膜形态与用生理盐水和γ-CD处理过的黏膜相似。张奕研究了β-CD和MD-β-CD对SDC鼻纤毛毒性的影响。结果显示制成这两种环糊精包合物后，SDC的鼻纤毛毒性显著改善，大鼠体内吸收实验表明，包合物能显著地促进L一酪氨酸、胰岛素的鼻腔吸收。