如何做好RNA质控
凯杰
样品中RNA的纯度及整体质量对于后续的实验有重要的影响。
以下是进行PCR array前RNA质控的推荐标准:
定量:NanoDrop/Spectrophotometer(用于检测样本中的核酸浓度,蛋白与核酸的比例及是否存在污染,例如有机物/盐离子等污染)。请记录样品的浓度,230,260及280的吸光值。此方法无法评估RNA的完整性。
● 浓度:最佳浓度是100-150ng/uL。如果低于此浓度,可以使用PreAMP system或者通过浓缩的方法提高RNA浓度。可以通过配套的QIAGEN 过滤柱,减小洗脱体积来实现样品的浓缩。通过拨打QIAGEN客户服务热线400-880-0325,可以获得样品浓缩方面的帮助。
● 260/280比值:这一比值用于反应RNA浓度与蛋白浓度的比值。理想值应当在1.8-2.0,如果比值低于1.8,表明存在蛋白或其他污染。
● 260/230比值:这一比值用于反应RNA浓度与共提取污染的比值。理想值应当在1.8-2.2,如果比值低于1.8,表明存在有机物/盐离子等污染。这些污染会影响后续qPCR反应。
RNA完整性检测:
通过凝胶电泳或bioanalyzer来分析RNA的完整度,从而保证RNA的质量,防止RNA的降解对后续实验的影响。以下内容是RNA完整度的通用标准:
● 28S/18S比值:>1.5为高质量,1.3-1.5勉强可用,<1.3为较差质量
● RNA Integrity Number (RIN): > 7为高质量,6-7勉强可用,< 6为较差质量
RNA完整性的图例:(A)较好,(B)勉强可用,(C)较差
● 凝胶电泳的图例:泳道1,2为较好,泳道3勉强可用,泳道4为较差的质量