甲基化酶（Methylase）的种类及其对限制性酶切的影响

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一、甲基化酶的种类

原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。在 E.coli 中，大多数都有三个位点特异性的 DNA 甲基化酶。

1.Dam 甲基化酶

Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。一些限制酶(PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ)的识别位点中含 GATC 序列，另一些酶 ClaⅠ(1/4)、 XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅠ(1/16)、 HphⅠ(1/16) 的部分识别序列含此序列，如平均 4 个 ClaⅠ 位点(ATCGATN)中就有一个该序列。

有些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。对甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。

一般哺乳动物 DNA 不会在腺嘌呤 N6 上甲基化，因此对甲基化敏感的限制酶切割这些 DNA 不会受到影响。当需要在这些敏感位点上完全切割 DNA 时，可利用 dam- E.coli 扩增并提取 DNA 。

2.Dcm 甲基化酶

Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ(↓CCWGG)。大多数情况下，其同裂酶 BstNⅠ(CC↓WGG)可避免这一影响，因为二者识别序列虽然相同，但切点不同。

受此甲基化酶影响的酶还有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。不受此甲基化影响酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。

3.EcoKⅠ 甲基化酶

EcoKⅠ 甲基化酶的识别位点少，识别 AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因为识别位点少(1/8kb)，所以研究较少。

4.SssⅠ 甲基化酶

SssⅠ 甲基化酶来自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链(新合成链)的 DNA 链。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 系统的限制。许多酶对此甲基化敏感，如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等，也有不敏感的，如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ 。

二、依赖于甲基化的限制系统

E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列，都限制由 CpG 甲基化酶(M SssⅠ)作用的 DNA (限制即消化降解)。 Mrr 限制 m6A ; McrA 限制 HpaⅡ 甲基化修饰的位点; McrBC 切割两套半位点(G/A)mC ，这两套位点之间间隔 2kb ，最适为 55～103bp ，需 GTP ;大多数常用的 E.coli 都含这三个限制系统中的一个或几个，三个都不限制 Dcm 修饰的位点，Mrr不限制 dam、 EcoKⅠ、EcoRⅠ 修饰的位点。

三、甲基化对限制酶切的影响

1.修饰酶切位点

HincⅡ 可识别四个位点(GTCGAC、 GTCAAC、 GTTGAC 和 GTTAAC)，甲基化酶 M.TaqⅠ 可甲基化 TCGA 中的 A ，所以 M.TaqⅠ 处理 DNA 后， GTCGAC 将不受 HincⅡ 切割。

M.MspⅠ 修饰的产物为 m5CCGG ，在 BamHⅠ 识别位点(GGATCC)前面如果为 CC 或后面为 GG ，那么经 M.MspⅠ 处理的 DNA (GGAT m5CCGG)对 BamHⅠ 不敏感(即抵抗切割)。

构建 DNA 文库 时，用 AluⅠ(AG↓CT) 和 HaeⅢ(GG↓CC) 部分消化基因组 DNA 后，将得到的片段用 M.EcoRⅠ 甲基化酶处理，然后加上合成的 EcoRⅠ 接头，再用 EcoRⅠ 来切割时只有接头上的位点可被切割，从而保护基因组片段。

2.产生新的酶切位点

通过甲基化修饰可产生新的酶切位点。 DpnⅠ 是依赖甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 处理后形成甲基化(A)产物 TCundefinedATCundefinedA ，其中 undefinedATC 即为 DpnⅠ 位点。

3.对基因组作图的影响

在研究哺乳动物 m5CG 、植物 m5CG 和 m5CNG 、肠道细胞 Gm6ATC 的甲基化水平和分布时，利用限制酶对甲基化的敏感性差异，大有作为。