信号放大时间分辨荧光分析技术的研究进展及应用

近些年来，非同位素标记分析技术发展迅速。它主要包括：酶标记分析技术、化学发光分析技术、生物发光分析技术和时间分辨荧光分析技术。信号放大时间分辨荧光分析技术克服了其他技术的缺点，具有非同位素、灵敏度高、标记物制备简单、测量快速和分析动态范围宽等优点，成为一种最有发展前途的非同位素标记分析技术。

一、信号放大时间分辨荧光分析技术的原理及特点

信号放大时间分辨荧光分析（time-resolved fluorescence assay，TRFA）技术是把生物信号放大、镧系元素螯合物的固有优点以及时间分辨和波长分辨两种测量技术合为一体，极其有效地排除了非特异荧光，测量了特异荧光，因而灵敏度很高。

信号放大时间分辨荧光分析技术的优点归根到底是源于镧系元素螯合物的固有特点［1］。它们是：

（1）激发光谱带较宽，可以增加激发能，提高标记物的比活性。

（2）发射光谱带很窄，50%发射谱带的宽仅约为10nm，可以利用通带滤光片，只允许峰值波长±5nm谱段通过供测量，在如此窄的谱段内，非特异荧光很少，可有效降低本底荧光，且能量损失也不大。

（3）激发光与发射光之间的stokes位移大，有利于排除激发光散射等的干扰。

（4）镧系离子螯合物的荧光寿命很长，约1ms,在时间分辨荧光仪上测量时，脉冲光源激发后，可适当延迟一段时间，待其他短半衰期（1～10ns）的非特异荧光完全衰变后再测量，从而极大的降低了本底荧光，实现了时间分辨，灵敏度大大提高。

（5）镧系离子由激发态跃迁到基态时发射荧光，在测量时间内可反复激发镧系离子，相当于大大提高了标记比活性。

此外，时间分辨荧光分析技术的分析动态范围宽，可达4～5个数量级；标记物制备简单，稳定性好，有效期长，不受半衰期影响；标记蛋白质时反应条件温和，蛋白质活性受损少；测量快速，易于自动化。

二、生物素—链霉亲和素系统放大的时间分辨荧光分析

1988年，出现了一种新的双功能螯合剂，称为4,7-双（氯磺酰基苯基）-1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸［4,7-bis(chlorosulfophenyl)-1,10-phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid,BCPDA］，为了增加生物放大又把生物素-亲合素系统（biotin-avidin system,BAS）引入免疫反应系统。

本分析系统的基本原理是：固相McAb与抗原反应后，再加入生物素化McAb，形成免疫反应复合物，再加入通用试剂SA-BCPDA-Eu3+，其中SA是链霉亲合素（streptavidin，SA），借助SA与生物素的高特异和高亲合力的结合，把这种通用试剂连接到免疫反应复合物上，最终形成的复合物为：固相McAb-抗原（标准或样品）-（McAb-生物素）-（SA-BCPDA-Eu3+）［2］。

本分析系统的特点是不用增强液，可在固相下直接测荧光。该系统共有三次放大作用，但放大倍数仍然远小于增强液系统，灵敏度可能略低，为此也有学者在最后一步加入增强液，进行液相荧光测定。

三、酶放大时间分辨荧光分析　　

酶放大时间分辨荧光分析（enzyme-amplified time-resolved fluorescence assay, EATRFA）系统，它的核心思想是把生物素-链霉亲和素的高亲和力和放大作用、酶放大作用、镧系元素螯合物的特有优点和时间分辨测量技术结合，不用增强液，在液相下测量荧光。

其基本原理是：固相McAb与抗原和生物素化McAb同时反应，形成免疫反应复合物；然后再与碱性磷酸酶（ALP）标记SA的复合物ALP-SA反应，形成复合物（固相McAb-抗原-McAb-生物素-SA-ALP）。

再加入ALP的底物5-氟水杨酸磷酸酯（5-fluorosalicyl phosphate，5-FSAP），生成产物5-氟水杨酸（5-fluorosalicylic acid，5-FSA）。再加入铽（Tb3+）—乙二胺四乙酸（EDTA）螯合物，在高pH下，形成荧光寿命长、荧光产额高的三元复合物FSA- Tb3+-EDTA。测定546nm波长的荧光强度即可得抗原浓度［3,4］。在本法中，环境改变和淬灭体对荧光发射特征影响极小；镧系元素污染的影响也非常小［5］；在液相下测荧光，不用分离，非常简捷。

四、二次酶放大时间分辨荧光分析　　

近年又提出二次酶放大时间分辨荧光分析系统［3,6］，用于核酸杂交分析。其原理如下：先用抗体包被微滴定孔，再经特异抗原标记的靶DNA与该抗体反应，将靶DNA连接到固相抗体上。

然后用生物素化探针与靶DNA杂交，再通过生物素与链霉亲和素的反应，将链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶（HRP）连接到杂化物上。当加入含有H2O2和生物素化酪胺（B-T）的HRP的底物溶液，因有H2O2存在，HRP在催化酪胺氧化，产生游离基团的同时，也催化事先固定在微滴定孔表面的蛋白质（如白蛋白）的酪胺酰基的氧化。由于二聚体形成反应，于是B-T就共价地结合到固相上。

再加入ALP-SA，经B与SA的反应，ALP结合到固相上。至此，实现了杂交和建立了杂交的定量关系。洗涤后，加入ALP的底物5-FSAP，此后的步骤与EATRF分析系统的相同。二次酶放大时间分辨荧光分析系统的主要目的是增加放大倍数，大大提高分析灵敏度。有报告称此系统的特异信号可增加30倍，信/噪比可改进10倍，灵敏度可达3×10-16mol［7］。

荧光光谱明确可靠。测量荧光强度时，溶液中有5-FSA：EDTA：Tb三元复合物，它的最大吸收波长与仪器的激发波长337nm几乎相等，很匹配，它的四条发射谱带中547nm谱带的强度最强，用（547±5）nm的窄通带滤光片，只允许其通过，是供测量的荧光信号。5-FSAP本身不发荧光，也不能与Tb-EDTA结合成复合物。游离的5-FSA只发射420nm波长的荧光，也被滤光片滤掉。

EATRFA系统的优点是：灵敏度非常高，对PBR322DNA的杂交分析，国外Evanglista等报道为3pg［8］，国内赵启仁等报道为10pg［3］，而二次EATRFA系统的灵敏度更高；分析系统简单，全过程操作，可以一管到底，在检测荧光强度时，不需要分离，可直接在液相下测量；分析快速，测定全过程只需要十几小时。

且主要是温育需要过夜；相关试剂的有效期长；不存在放射性对人体的危害等问题；不存在金属离子污染问题；环境改变和淬灭体对荧光特征发射的影响极小；有利于分析自动化实现。

五、纳米颗粒的应用

近几年来，纳米颗粒应用到时间分辨荧光分析技术中。每个纳米颗粒含有数千镧系元素螯合物，这样可以大大提高标记比活性。在均相时间分辨荧光分析中，使用纳米颗粒技术，当激发光激发时，大量增加的镧系元素螯合物作为能量供体将能量传递给能量受体，传递的能量增加，受体所受的激发荧光强度也大大增加。

Harma等和Kokko等分别报告了用铕纳米颗粒和时间分辨荧光免疫分析技术进行了超灵敏的前列腺特异抗原（PSA）和雌二醇的测定［9，10］。

六、滚动循环放大时间分辨荧光分析

由于ELISA等酶免疫分析的灵敏度和特异性受限，特别是当分析材料或抗原的量很少时，2000年，Schweitzer等［11］利用滚动循环放大（rolling circle amplification, RCA）进行了超灵敏的抗原测定。滚动循环放大用于蛋白抗原类的测定，被称为“immunoRCA”。它是一个多元化的分析系统，可以一次检测多种抗原，可用于免疫诊断和基因诊断。

“immunoRCA”的原理是：将抗原（标准或待测样品）包被在固相上，加入共价连接寡核苷酸引物的抗体。通过抗原和抗体的特异结合，寡核苷酸引物连于固相。这样，在环状DNA、DNA聚合酶和核苷酸的存在下，进行扩增。扩增的结果就是一条很长的DNA分子，它包含了数百个拷贝的环状DNA序列［12］。

这时，我们用生物素化的探针和其杂交，利用生物素-链霉亲和素系统对扩增产物DNA的量进行时间分辨荧光测定。因为在一定范围内，所得扩增DNA的量正比于固相的量，所以可以定量固相抗原。

“immunoRCA”具有灵敏度高，特异性强；测定快速，动态范围宽；不需要特殊的设备，操作更简便；避免假阳性结果；检测结果更准确等优点［13,14］。

“immunoRCA”不仅可用于蛋白抗原类的测定，其基本原理还可应用于点突变检测以及直接检测病毒DNA或RNA来诊断病毒感染。2003年，Wang B等用RCA高效地测定了SARS-CoV病毒DNA［15］。2005年，Silander K等用少量DNA经过多样引物进行了SNP基因扩增的评估［16］。

七、免疫PCR时间分辨荧光分析

很多疾病的生命和分子基础的基本原理的阐明，需要研究生物分子的相互作用，甚至是在单个细胞或单个分子水平上的这种作用。多数自然过程涉及蛋白质和其他非核酸物质，因此，单是核酸分析还是不足以探索生物原理。

为了把PCR的近乎指数的扩增能扩展到蛋白质的高灵敏度测定，Sano et al［17］创立了免疫PCR法（Immuno-PCR，IPCR）。IPCR是一种检测微量抗原的高灵敏度技术。它把抗原抗体反应的高特异性和PCR的高灵敏感性有机地结合起来。

它的基本原理是：用一段已知DNA分子标记抗体作为探针，利用抗体和抗原的特异结合，把此探针连接到待测抗原上，PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。

IPCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法，理论上可以检测单个抗原分子，实践上它的灵敏度比ELISA法高100～10000倍［18］。由于PCR产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比，因此IPCR还可进行抗原的定量［19］和半定量试验。

IPCR的连接分子是指IPCR中需要的连接报告分子和抗原抗体复合物的中间桥分子［20］。主要有：重组的链霉亲和素-蛋白A嵌合体，蛋白A可与抗体的Fc段结合，而链霉亲和素可与DNA分子上的生物素连接。以及生物素化单抗-亲和素-生物素化DNA分子复合体及其修饰物［21］。研制新型连接分子是IPCR的一个研究热点。

要求用作IPCR报告分子和PCR扩增系统有良好的扩增效果，具有近似理论的扩增率。与反应系统中可能存在的DNA分子不应有同源性。目前用的较多的是DNA聚合酶将生物素化的碱基聚合到DNA末端，理论上一条DNA链上标记一个生物素分子时灵敏度最高。

PCR产物经葡聚糖凝胶电泳后，EB染色，紫外线灯下观察或照像，出现特异性扩增带为阳性。另外，在PCR扩增时应用生物素标记，再与碱性磷酸酶标记的链霉亲和素反应，再加入ALP的底物5-FSAP，产物为5-FSA，再加入含Tb-EDTA的荧光发展溶液，可用时间分辨荧光仪测荧光强度。当然也有用放射性同位素和荧光素的。

IPCR应用很多，目前主要用于检测肿瘤标志物、细胞因子、神经内分泌活性多肽、病毒抗原、细菌、酶、支原体、衣原体等微量抗原。到目前不完全统计有各种检测40多种［22～24］。

八、时间分辨荧光淬灭分析

时间分辨荧光淬灭分析（time-resolved fluorescence quenching assay，TRFQA）是建立于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）理论［25］上的一种分析系统。在此分析系统中，能量是从一个镧系元素螯合物转移到一个非荧光淬灭体。

双链DNA探针，其中一条链的5′端标记镧系元素螯合物，另一条单链的3′端标记荧光淬灭基团。当标记有镧系元素螯合物的单链与靶DNA杂交时产生荧光信号，而游离的该种单链与标记有荧光淬灭基团的单链结合时，荧光信号被荧光淬灭基团淬灭。

这样大大减小了背景荧光，提高了灵敏度［26］。2006年，Wang等进行了抗引物淬灭的实时PCR和临床癌症样品的分析［27］。Santangelo等用纳米结构探针测定了活细胞中的RNA［28］。　

信号放大时间分辨荧光分析法是一种新型的超微量分析方法,由于它的优点突出，越来越受到关注,应用日益广泛。相信在不久的将来,随着生物技术的发展，对微量检测要求的提高，具有高灵敏度的信号放大时间分辨荧光分析将在更多的领域内得到广泛应用。　

【参考文献】

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