蛋白质纯化之胶体过滤法

一、仪器设备：

1.色析管柱（Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；

2.部分收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；

3.浓缩用离心机（低速5,000 rpm）；

4.浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322）。

二、药品试剂：

1.胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：

（1）预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。

（2）胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。

（3）Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。

2.Buffer A-150：注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致。

3.标准分子量组合（Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL。含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1,350kD）。

三、方法步骤：

1.管柱装填：

（1）以纯水冲洗玻璃管柱（以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。

（2）依预估量取出Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否一致；将瓶中的胶体上下震荡，使其完全悬浮，但勿产生太多气泡。

（3）在管柱内加入约10 cm 高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沉降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约90 cm。

（4）胶体完全沉降后，小心以buffer A-150 加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。 调整缓冲液瓶高度，使流速约每五~六秒一滴，并设定收集体积为2.5 mL/tube。

（5）胶柱流洗约100 mL 后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高，注意勿破坏胶体表面平整； 然后打开出口，使液面下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。

2.样本色析进行：

（1）以微量移液器或滴管吸取样本 （样本体积不得超过胶体总体积的3%），沿着胶体上方管壁缓慢加入，注意切勿破坏胶体的平整表面！（样本确实体积 _______ mL）

（2）打开出口，同时开启部分收集器；当样本完全没入胶体时，关闭出口，缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150，打开出口待其慢慢进入胶体中，如此重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。

（3）暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6 s 一滴。

（4）要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约80 管。

（5）收集试管，进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定，并请作图。

（6）收集GUS 活性区，以Centriprep-30 浓缩至10 mL 后，加buffer A-0 稀释至20 mL，再次浓缩至 _______ mL （GF），保留100 μL。

（7）管柱请再以buffer A-150 流洗100 mL 后，小心放置一旁，准备以后进行分子量测定。

3.分子量测定：

（1）进行分子量测定前一天，请先以buffer A-150 流洗100 mL，并检查胶柱内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。

（2）取标准分子量溶液0.4 mL，加上纯质目标酶0.5 mL （以亲和层析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集。请依循上述所有管柱及部分收集器的操作要点。

（3）收集后，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出vitamin B₁₂的溶离管数。利用以上数据，可画出分子量与溶离管数间的直线关系，作为分子量判定的标准校正线。

（4）同样的一批分划，请进行酶活性分析 （GUS），则可定出酶的溶离体积，对照上述标准校正线，则可求出酶的分子量。

4.拆除管柱及保存胶体：

（1）若管柱长期不用，应当自管柱中取出胶体，以缓冲液清洗后，置冷藏室中保存，但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧，有时可能不易取出，要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。

（2）胶体可以加0.01% NaN₃防止霉菌生长，但使用前记得要洗去；再度使用时，请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒，若有结块而不易打散者，也不要使用。