过滤法

滤膜法是采用滤膜过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，其孔径约 0.45　μm。

1. 滤膜灭菌

将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸 15 分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤 23 次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。

2. 滤膜过滤器装置

用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶按图 1 装配好，其中滤膜用灭菌镊子（浸在 95％ 酒精内，用时通过火焰灭菌）移至过滤器的基座上。其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。

图 1　滤膜过滤器装置

3. 将抽滤瓶接上真空泵。

4. 加水样过滤

直径 35 mm 的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数不多于 50 个为适宜。一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300～500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样 1～100 ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。本次实验于过滤器漏斗内加入比较清洁的河水或湖水 100 ml，加盖。

5. 开动真空泵进行油滤。

6. 抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。

7. 滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在伊红美蓝琼脂平板上，如图 2。滤膜与培养基之间不得有气泡。

图 2　从滤膜座上将滤膜转移到 EMB 琼脂平板上及培养后的菌落图

8. 将平板倒置于 37 ℃ 下培养 22～24 h。

9. 选择符合大肠菌群菌落特征的菌落，进行计数。

10. 计算

1 L 水样中的大肠菌群数＝滤膜上的大肠菌群菌落数×10