质粒提取常见问题

1.溶液I―溶菌液:

溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA 受机械剪切力作用而降解。

EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2.溶液II-NaOH-SDS液:

NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA 与质粒DNA 的变性。

SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA 时)受到干扰。

3.溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:

NaAc的水溶液呈碱性,为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液,调回pH至中性,使变性的质粒DNA 能够复性,并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA 、RNA 以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。

4.为什么用无水乙醇沉淀DNA ?

用无水乙醇沉淀DNA ,这是实验中最常用的沉淀DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA 很安全,因此是理想的沉淀剂。

DNA 溶液是DNA 以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA 周围的水分子,使DNA 失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA 相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA 在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA 损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA 时可用95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA 。一般在室温下放置15-30分钟即可。

5.在用乙醇沉淀DNA 时,为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1~0.25mol/L?

在pH为8左右的溶液中,DNA 分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA 分子上的负电荷,减少DNA 分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA 钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA 形成DNA 钠盐而聚合,这样就造成DNA 沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。

在沉淀的DNA 中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA 的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。

6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA ,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。

7.为什么在保存或抽提DNA 过程中,一般采用TE缓冲液?

在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。

磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA 的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA 反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA 时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA 的活性。

8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA ?

采用PEG(6000)沉淀DNA ,大小不同的DNA 分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA 分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%。

本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA ,每毫升加入0.4毫升的30% PEG,其最终PEG浓度为12%。PEG选择性沉淀DNA 的分辨率大约100bp。

9.抽提DNA 去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?

酞与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA ,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA 。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。

10.为什么用酚与氯仿抽提DNA 时,还要加少量的异戊酵?

在抽提DNA 时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24:1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24:1的氯仿与异戊醇即成),同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

11.为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?

因为酚与水有一定的互溶,苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA 过程中,不致吸收样品中含有DNA 的水分,减少DNA 的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA 在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5~7),RNA 比DNA 更容易游离到水相,所以可获得RNA 含量较少的DNA 样品。

保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA ,一般不可以便用。为了防止酚的氧化,可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1%。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制DNase的活性,它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空气,以装满盖紧盖子为宜,如有可能,可充氮气,防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中,使用时,打开盖子吸取后迅速加盖,这样可使酚不变质,可用数月。