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全基因组扫描

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基因组扫描

遗传 分析仍是当前对致病相关基因识别、鉴定的主要方法,分为连锁分析和关联研究两种。由于人类基因组多态性的研究以及SNP分型技术的发展,目前全基因组连锁分析和关联研究亦变得切实可行。

根据研究规模的大小,可以将疾病遗传分析分为以下几类,即定位克隆、连锁不平衡基因定位、全基因组候选基因分析、候选基因关联研究和定位候选基因克隆,其中定位克隆、连锁不平衡基因定位和全基因组候选基因分析均属于全基因组扫描。

不管是单基因疾病还是多基因疾病,通常是先行全基因组扫描(genome scanning);将疾病相关位点定位于染色体某个区域,然后再行候选基因策略或连锁不平衡分析,确定致病基因位点。如果利用家系进行连锁分析,即采用定位克隆;若是利用群体样本,则应用连锁不平衡分析进行基因定位。全基因组扫描已成功地应用在许多疾病的致病相关基因克隆上,并取得了一定的成果。

全基因组扫描所利用的是在人类基因组大量存在的微卫星或SNP,虽然当前使用较多的仍是微卫星,但由于芯片技术的发展,全基因组高分布密度的商品化SNP芯片相继面世(如Affymetrix公司的10k,100k和500k人基因组SNP芯片),越来越多的研究者使用SNP进行全基因组扫描。由于这些高密度的SNP芯片价格昂贵,不是一般的实验室所能承受。

微卫星全基因组扫描的原理是利用特定的引物将某条染色体上特定位置的微卫星扩增出来,并进行分析。这种分析所使用的微卫星通常具有较高的多态性,在不同的个体其长度不尽相同(也就是微卫星基本单位重复次数的不同),而不同长度的PCR产物则代表某一位点不同的等位基因。

该种分析方法实际上是利用平均分布于各条染色体上的密度约为10cM的微卫星,检测每个微卫星是否存在与其邻近的疾病相关基因座位连锁。

全基因组扫描并不能直接搜寻具体的疾病相关基因,而是通过研究均匀分布于整个基因组的微卫星标记来间接选择其相关的基因座位。

在得到阳性结果后,又可在这些阳性位点附近再加密微卫星标记或利用SNP,用同样的方法来确定哪一个多态性位点与疾病连锁的可能性最大等等。这样在不断地缩小分析范围后,疾病相关基因定位的范围也越来越精细。

由于人类基因组序列已知,一旦发现了与疾病相关基因连锁两侧的遗传标记,根据标记位点的具体位置,我们就可以知道定位区域内所有的基因。因此,当定位区域确定后,在该区域内选择候选基因直接进行测序,对所发现的突变在病人和对照组进行分型并分析,搜寻致病基因。

另一个方法是直接从公共数据库挑选候选基因编码区、调控区(包括内含子)中的SNP,进行连锁不平衡分析,确定致病基因。

虽然单个SNP的多态信息量(polymorphism information content,PIC)不如微卫星,但在相同的PIC值的要求下,SNP图谱的密度为微卫星图谱的2.25―2.5倍。因此在相同的信息提取效果下,利用10cM间隔的微卫星图谱即300个左右的微卫星标记进行初期定位,与4cM分辨率的约750个SNP图谱差不多,显然后者对基因定位的范围更精细,因此利用SNP标记能检测出微卫星标记不能探测到的疾病相关区域。

随着人类基因组的重测序和DNA芯片技术的不断完善,目前已有应用于全基因组扫描的SNP芯片,如Affymetrix公司的GeneChip Mapping 500K ArraySet、100kArraySet和10k的SNP芯片(SNP数目分别约为50万、10万和1万)。显然这些芯片的SNP分布密度以及信息度大大高于定位克隆常规使用的微卫星,并已成功应用于疾病相关基因的研究。预计随着SNP芯片的进一步完善和成本的降低,将是未来疾病相关基因研究的主流技术。

全基因组扫描用的成套微卫星引物,可多达上千个。引物的5’末端标记在激光激发下可发出不同颜色光的荧光素标记,如此可进行多重PCR,加速实验的进程。每一样本的PCR产物长度大小可以通过ABI或MegaBACE等测序仪进行检测。

通过收集每一个个体的相关信息,经软件分析后即可得到结果。而采用Affymetrix公司的全基因组高密度的SNP芯片,操作更为简单。每个个体的DNA经酶切、PCR扩增、荧光标记、杂交扫描后即可得到每个个体上万个SNP的具体信息,经遗传分析后就可得到定位结果,且定位的区域一般比微卫星定位的小很多。

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