Bioanalyzer “眼”中的 RNA

经常做RNA实验的朋友可能都会有所感触，RNA比较脆弱，容易降解。有的时候RNA可能会在不知不觉中“消失”了，而RNA的质量又关系到后续实验的成败，所以保证RNA的质量有着至关重要的作用。

最为常用的检测RNA 质量的方法是电泳法，比较容易成本低，但是比较耗时，需要的样本量比较大，同时不能够反应足够的细节。

有的时候，我们可能仅仅能够拿到很少量的RNA，是很难用电泳法来检测的，比如说少量的Poly A+RNA或miRNA样品等等。这个时候怎么办？

很多时候若是没有办法，也只能是硬着头皮继续往下做，有结果了就很高兴好像也说明RNA没有问题，若是没有结果又很难说明问题是出在那里，真的是令人头疼。不过，话又说回来，有结果就说明原来的RNA没有问题吗？你知道你所使用的RNA的细节吗？

若是用bioanalyzer来分析和检测RNA的质量就要容易得多，并且很敏感，很少的样本就可以用来检测，并且结果的可重复性非常高，但是需要专用的仪器，试剂等，所以费用较高。

bioanalyzer 到底能干什么？下面的图表会给你一个较为清晰的了解和认识，看来用处还不少呢！bioanalyzer在检测RNA的质量方面绝对是有独到之处的，相信大家看完我所提供的图片就会更加相信这一点的。

bioanalyzer的操作也是非常简单容易的，可以简单的来说上样，点击软件的start，然后40分钟左右看结果。这个时间与你的样本数量和片子类别有关系，通常来说，smallRNA和DNA的chip需要的时间长；样品数量多需要的时间长，废话，地球人都知道！

bioanalyzer的原理简单来说就是毛细管电泳。

Bioanalyzer 常用的检测RNA的chip有：RNA nano，RNA pico和small RNA。顾名思义，small RNA就是来检测small RNA（小于200bp）的；前两者没有本质的区别，主要是原始样品的量和浓度的不同，若是你的样本量很少或者浓度很低，就用RNA pico，这样仅仅需要100pg的RNA你就可以检测你的RNA质量了。

这些简单的几笔之后，再说说样品的制备，也就是上样RNA的抽提。

这个也实在是没有什么可说的，原因之一：版上太多的牛人和牛贴了，只有你用心考古，那收获是大大的有；原因之二：我的经验虽然可以说是丰富，但是都是在条件比较好的基础上的，因为我都是使用各个公司的kits和直接购买的RNasefree的水，所以根本就没有类似怎样用DEPC处理水等等相关经验。

我所用过的提取RNA的方法有：Invitrogen的Trizol，QIAGEN的RNeasy kit, miRNeasy kit, Ambion 的mirVana kit等等，现在Invitrogen和Ambion已经是一家了。这些kit可以说是各有优缺点吧，建议大家根据自己的需求，来选用较为合适并且经济的方法，决不要别人一说好，你就冲上去了。准备购买时，强烈建议先到官方网站下载manual仔细阅读之后，再做决定。

简单提一下的是若是用RNeasy kit提取RNA的话，若是完全按照protocol你可能会丢掉smallRNA（当然可以通过适当的改变protocol中的一些细节来保留这些small RNA），虽然你可能会在电涌图或bioanalyzer上面看到少量的small RNA，但那主要是5S和5.8S的rRNA，而miRNA和tRNA 基本 都没有了，所以若是做small RNA相关工作的话，尽量不要用RNeasy kit！同时，用氯化铯高速离心的方法，也会丢失small RNA。

我的RNA制备流程-----仅供参考！

或许有的人会奇怪，这还有什么流程啊，直接提取出来，然后就往下做呗！不过，为了样品能够尽量统一，尽量去除可能会影响实验结果的因素，我们实验室“统一”了RNA制备流程。建议做microarray（已经很少有人做了）和RNA seq的朋友，要珍惜你手中的资源，最好是确保已经拿到高质量的RNA之后，再往下做，否则可能拿不到数据，或即使拿到数据，也很可能是有问题的数据。

1，提取RNA

按照protocol提取出RNA

2，乙醇第一次沉淀RNA

为了去除提取过程中可能的污染等，进行第一次RAN沉淀，同时可以根据RNA量来适当的浓缩或稀释

3，DNase 处理 RNA样品

虽然，现在的提取方法能够很大限度的除去DNA的污染，但是不怕一万就怕万一，极少量的DNA污染，可能会摧毁整个实验，或造成假结果，所以必须要干掉DNA

4，样品 clean up

5，乙醇第二次沉淀RNA

重悬RNA时，适当调整水的体积，为后续试验尽量铺平道路

经过这个“复杂”的流程，你就可以拿到一个相对来说， 比较满意的RNA了。很多人是不愿意这样做的，倒不是因为费时费力，而是因为他们认为RAN太“脆弱”了，是禁不起“折腾”的。其实，不然，若是你没有外源型的RNA酶污染，RNA是非常禁得起折腾的。

废话一堆之后，现在概括一下这个帖子会涉及到的各种RNA:

1，细胞总 RNA （其中包括total RNA, total long RNA 和 total small RNA）

2，细胞质RNA（其中包括Cytosol total RNA, long RNA和 small RNA）

3，细胞核 RNA（其中包括Nuclear RNA, long RNA 和 small RNA）

4，细胞核仁RNA（其中包括Nucleoli total RNA, long RNA 和 small RNA）

5，细胞染色质RNA (好像只有total RNA,没有进一步分出大小)

6，细胞核质 RNA (好像只有total RNA, 没有进一步分出大小)

7，细胞线粒体RNA (好像只有total RNA, 没有进一步分出大小)

8，相互之间的对比或其他RNA，比如Poly A+和Poly A- RNA等等

下面这个图片来自RNA nano chip的数据，一共是12个样品，分别来自三个细胞系：GM12878，HepG2和K562。

接着是与此对应的胶图，最左面的是ladder，然后依次是12个样品：为了更清楚和漂亮一些，我们可以把上面的胶图更改为黑色背景，这样就更像凝胶电泳图了，呵呵

细胞总RNA

样品来源：GM1287细胞；RNA提取方法：Invitrogen Trizol， Qiagen miRNeasy kit 或 mirVana kit

BTW：虽然很多人说Trizol提取small RNA不是很理想，但是由于样品来源及其他条件的限制，有的时候，我不得不使用Trizol提取总RNA（包括small RNA），就bioanalyzer的结果来说，Trizol是可以提取small RNA的，而且最后从RNA seq的数据来看，与mirVana提取的没有本质差别。

我本来计划把对应的胶图放到一起，不过因为我的电脑里没有photoshop，所以暂时做不了，于是就先仅仅提供电泳峰值图，不过要知道，一个峰对应电泳图中的一个条带，峰越高，对应的条带就会越“亮”！

因为以后的帖子中进行对比时，有的时候是峰值的“大小”不同，有的时候是峰的缺失，所以在这里将这几个“峰”简介一下：

简单来说，这个图片中有5个“峰”，他们从左到右依次是：

第一个：似乎很小，对应的位置是25，这个peak是一定会出现的，因为他是marker peak，他对应胶图中的是最下面的绿色条带，若是他缺失了，那说明可能是操作等有误，所得的数据不可靠！

第二个：似乎也不大，对应的位置是小于200，这是small RNA peak，也可以说是一组peak，其组成有miRNA，tRNA，5S rRNA和5.8S rRNA等等

第三个：比较大，对应的位置在近2000，这个是18S rRNA peak

第四个：非常大，对应的位置在4000左右，这个是28S rRNA peak

第五个：很小，紧紧接着28S rRNA peak，这个应该是precursor RNA peak，他在细胞的不同部位，表现非常不同。比如说细胞核中很大，而在细胞质中缺失；在代谢旺盛的细胞中比较大，比如肿瘤细胞，而在代谢缓慢的细胞中就比较很小。

这是最为常见的5个peak，不同的样品中可能会有所不同，有的样品中可能会有更多的peak，比如说植物细胞的RNA等等。

其实，除了这5个peak之外，我们还能看到一些东西———那些略略高于基线的从small RNA peak开始一直到最后的peak的都有一些东西藏在那里，那些就是mRNA。想一想，若是你能除掉rRNA等干扰，提取到非常纯的mRNA，那么电泳结果就应该是涂布状。

万里长征（整个实验）的第一步，我们似乎很顺利的走过了，因为我们已经拿到了质量很不错的细胞总RNA，但是由于实验的需要，我们需要把总RNA分为大于200bp的long RNA和小于200bp的small RNA。

OK！让我们开始吧！我所用的kit是Qiagen的miRNeasy kit或Ambion的mirVana kit。就这两个kit来说，最后的结果都差不多，操作的上手程度也都是很简单，他们都可以直接从细胞提取small RNA，也可以从总RNA中分离出small RNA。mirVana kit似乎更为经典老牌一些，但是miRNeasy kit也不落后，而且从性价比来说，miRNeasy kit要更为经济实用一些。

细胞总RNA中的small RNA：

上个帖子的图片来源于RNA nano chip，那末我们若是用同样的chip来检测small RNA样品的话，会是什么样的结果呢？答案是显而易见的——small RNA peak 之后的所有peak都消失不见了！来看图吧！

若是有一点long RNA污染，能不能看到呢？

再把这两张图片整合到一起，红色的显示有一点点的long RNA污染，不过，这点污染在普通的凝胶电泳中是看不到的。

补充上面的帖子：或许有的朋友会有疑问，为什么上面图片中对应的size会有很大的差别呢？就像我说的那样，因为ladder有的时候会有很大的移位，所以显示的size不准确，甚至很不准确。

看来我们已经拿到了比较满意的small RNA，但是我们还需要知道更多关于small RNA的细节。这个时候，RNA nano chip就会变得心有余而力不足了，但是我们可以用small RNA chip来检测我们手中的样品。

本来想找一个比较满意的图片给大家，不过，很遗憾，很多样品都因为上样浓度很高，造成一个很high的peak，所以一些细节都丢了，大家先将就看看，我若是找到更好的，再替换过来。

这是GM12878 total small RNA的图片，因为上样浓度很高，所以很多细节都很难看到了。

第一个peak，对应4的位置是marker peak，然后紧接着略高于基线的部分是miRNA部分，软件显示占总量的10%，再接着的是tRNA同时混有5S和5.8S 的rRNA peak。

在以后的帖子中，我们会看到更多的细节！

补充一张好像很不同的，HUVEC total small RNA：

整体的样式，他们还是差不多的，但是第二个图片中miRNA占了总数的40%。

再把这连个图片，放在一起，对比看看，蓝色的是HUVEC，在起始浓度比GM低的情况下，miRNA部分，仍然要比GM高很多！

我们暂时把small RNA放一下，因为当我们从总RNA中分离small RNA时，我们也同时拿到了long RNA，所以再来看看他们吧！

这是K562 total long RNA 的图片，和total RNA对比来说，就是small RNA的peak要低得多了。因为这两个样品不是同时检测的，所以很难把他们放在一起对比。上面的一张是total long RNA，下面的是total RNA，可以明显的看出他们之间small RNA peak的不同（还是不要看size，因为这两个chip的ladder跑的很不一样）。

上面的图片显示total long RNA中似乎还有少量的small RNA残留，那些是什么？

我们可以简单的通过下面的图片来对比：

这个图片中红色的是small RNA，蓝色的是long RNA，他们是来自同一个样品的total RNA。

由图片可以看出，残留的small RNA主要集中在对应的small RNA peak的后部，虽然这样不能证明我们已经分离出所有的miRNA和tRNA等，但是至少可以告诉我们，我们已经拿到了绝大部分的small RNA，尤其是miRNA。

OK！我已经拿到了一些total long RNA，但是RNA工作还没有完，因为我关心的是仅仅占RNA总量1-2%的mRNA，我不是很在乎那些占据绝大多数的rRNA，所以我必须除掉他们！

若是有足够多的total long RNA，可以分两步来做：一先先从total long RNA中提取Poly A+ RNA，二再用ribo Minus kit除去仍然残留的rRNA；若是没有足够多的total long RNA，就直接用ribo Minus kit除去rRNA。

Qiagen和Invitrogen都有kit来提取Poly A+ RNA，效果感觉差不多，不过好像有的人更喜欢Invitrogen的，Qiagen的要相对便宜点（单价贵，但是能够处理更多的总RNA）；ribo Minus kit现在也有几种了，我多是用Invitrogen的。

为了同时给出ribo Minus的对应图片，下面的结果不是来源于培养的细胞系，而是小鼠的肺组织。

RNA来源：小鼠的肺组织；提取方法：Invitrogen Trizol 提取总RNA——miRNeasy kit 分离small RNA和long RNA——从long RNA中提取Ploy A+ RNA——ribo Minus kit去除残余的rRNA。

Poly A+ RNA：仍然可以看到rRNA，但是总体质量还是很不错的。

ribo Minus之后的结果：rRNA的peak已经看不到了，但是这个bump略有前移，个人感觉ribo Minus之后，都有所前移。是有所降解？还是其他原因？

小结一下：

关于whole cell total RNA，我先后提供了whole cell total RNA，whole cell long RNA，whole cell small RNA，whole cell Poly A+ RNA等等图片。

其中关于细胞total small RNA可能有误，但是我暂时不改，因为好像无关大局，稍后若是我确定有误的话，我会回来更改或补充！错误的原因是我现在所提供的图片可能是cytosol small RNA，而不是whole cell small RNA，从bioanalyzer较多来说，这两种small RNA的区别很小，有的时候若是上样浓度过高的话，就更难区分了！