关于Plasmid 制备的技术解答

1. 质粒制备的基本原理是什么？

答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。

质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。

SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。

如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。

2. 质粒 DNA 制备的关键是什么？

答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。

3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？

答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。

4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？

答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。

使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。

5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？

答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。

判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因组，没有RNA污染。

6. 质粒制备的得率是由哪些因素决定的？

答：由细胞拷贝数，细胞的用量，属主细胞类型和和纯化方式。

7.您的质粒需要什么样的纯度？

答：根据您的实验目的确定您需要的纯度。对于一般的克隆分析鉴定，用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。

测序需要将质粒中的非核酸类杂质和RNA的水平控制在非常低的水平。基因组的存在对测序影响不大。开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒的测序效果基本相似。转染细胞纯度较高，用于基因治疗的最高，需要无热源，无内毒素 （LPS）。

8. 为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？

答：这种现象测序经常会发现，有些用户怀疑是我们搞错了。请相信，测序不可能将您的片段搞丢，测序结果是硬指标。

产生这种现象的直接原因是质粒制备过程中产生了变性的超螺旋质粒，它无法被限制性内切酶酶切；而正常的超螺旋质粒，酶切后变成线性分子，迁移率变小，酶切后变性与正常超螺旋质粒之间的距离加大。

变性的超螺旋质粒和正常的超螺旋质粒在酶切前靠得比较近，常被忽略。电泳分析酶切效果时，变性的超螺旋质粒常常被误认为是酶切下来的片段，导致误判。其实要判定这种假象非常容易，只要在酶切电泳分析时，增加不做酶切的对照就可以了。

9. 如何判定DNA 的纯度和浓度？

答：对于采用试剂盒抽提的DNA, 测定OD260和OD280浓度，OD260/OD280一般在1.7-1.8之间。1 OD260 = 50 μg/ml。需要注意的是，用简单手工抽提的DNA，OD260/OD280没有多大意义，由于含有水解的核酸小片段，该比值偏高。需要通过琼脂糖电泳来估计浓度。

10.为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？如何解决 ？

答：有人将问题的责任推到试剂盒的生产商，冤枉了。产生此的原因有很多，主要原因是核酸酶的污染。除了制备过程外源带入核酸酶外，但是根据有关报道发现，质粒属主细胞的种类会影响抽提核酸的质量。理想的用于抽提高质量质粒的细胞有DH5alpha, DH1, C600, XL1-Blue；HB101, JM系列细胞内含丰富的核酸酶活性，如果您制备的质粒准备长期保存，请换属主细胞。

11. 为什么小抽可以，一放大就不行了？

答：此种情况经常会发生，常使研究人员感到很困惑。原因主要出在大规模制备时细胞接种量和方式有问题，细胞裂解时溶液的用量和处理时间把握不准所致。大规模细胞培养正确的方式是从新鲜培养板上挑单克隆接种到2-5ml含合适抗菌素的培养基中，培养到对数期（8小时左右）；放大培养时需要将种子稀释500-1000倍继续培养12-16小时（通常是过夜培养）。摇瓶培养，摇瓶所接的培养基不要超过摇瓶总体积的25%。转速达到250转/分。

收集细胞没有什么讲究，采用的速度能将细胞沉下来就可以了。速度过高，细胞悬浮比较困难。大规模碱法制备需要选用合适的细胞用量，一般原则是细胞宁少勿多，溶液宁多勿少，变性时间宁短勿长。大规模制备采用的裂解溶液与细胞重量的比例小于小抽，细胞的裂解效果成为得率和纯度高低的关键。如果裂解不完全或采用的细胞过多，很多质粒不能充分的释放出来，有些释放出来的质粒也会滞留在各种沉淀物之间无法回收。NaOH-SDS (Solution II)变性过程是关键，溶液加入后通过上下颠倒小心混匀，如果发现细胞很难变澄清，表明溶液少了，整个变性过程应控制在5-10分钟，如果条件许可，预冷所有溶液。加入合适量的中和液(Solution III)要上下颠倒小心混匀数次，让抽提物真正做到中和，使基因组 DNA，蛋白质，细胞碎片充分的沉淀下来，才能保证后续可以得到高纯度的质粒。

还有一点需要强调是，接种的克隆新鲜十分关键。甘油菌，4度保存的菌液，时间很长的划板或转化板，都不是理想的种子。如果没有做过传代实验，不要直接采用甘油菌接种做大抽。

１２.常用抗菌素的工作浓度？

答：

Antibiotic	Stock Solutions	Working concentration
Ampicillin (Na)	100mg/ml in water   store at -20℃	50-200μg/ml
Chloramphenicol	34mg/ml in ethanol   store at -20℃	20-200μg/ml
Kanamycin	10mg/ml in water   store at -20℃	50μg/ml
Tetracyclin HCl	25mg/ml in ethanol,  store at – 20℃	50-100μg/ml
Carbenicillin	50mg/ml in 50% ethanol, store at – 20℃	50-200μg/ml
Rifampicin	34mg/ml in ethanol , store at -20℃	150μg/ml
Gentamycin	10mg/ml in water, store -20℃	15μg/ml
Hygromycin	10mg/ml in water, store at -20℃	10-400μg/ml
Spectinomycin	10mg/ml in water, store at -20℃	100μg/ml
Neomycin	10mg/ml in water, store at -20℃	100-800μg/ml
Kasμgamycin	10mg/ml in water, store at -20℃	1000μg/ml