常见扫描电子显微镜图像的缺陷和解决方法

扫描电子显微镜最基本的成像功能是二次电子成像。它主要反映样品表面的立体形貌。

由于样品的高低参差、凹凸不平，电子束照射到样品上，不同点的作用角不同，因此造成激发的二次电子数不同；再由于入射方向的不同，二次电子向空间散射的角度和方向也不同，因此在样品凸出部分和面向检测器方向的二次电子就多些，而样品凹处和背向检测器方向的二次电子就少一些；总之，样品的高低、形状、位置、方向等这些与表面形貌密切相关的性质，变成了不同强度的二次电子信息。

电子束逐点扫描产生不同数量的二次电子，依次在荧光屏上显示出亮暗不同的点，也就是相应的像素。再由这些象素组成了完整的二次电子图像。

1、荷电效应

当入射电子作用于样品时，从样品上会发出二次电子，其发射率会随入射电子的加速电压而变化。图1是表示二次电子发射率随入射电子的加速电压变化的曲线，图中横轴V0 表示入射电子的加速电压，纵轴σ表示二次电子发射数与入射电子数之比，即σ=二次电子发射数/入射电子数。

图1 二次电子发射随加速电压变化曲线

从图1 中可见，只有在V0=V01和V0 = V02时,σ等于1 ，即入射电子数与二次发射电子数相等，此时样品既不增加电子也没有失掉电子，样品不带电。除此两点外，样品会因吸收或失掉电子而带电。

如果样品不导电（生物样品一般不导电），此时样品会因吸收电子而带负电，就会产生一个静电场干扰入射电子束和二次电子发射，这些会对图像产生严重影响，此称荷电效应。它会对图像产生一系列的影响：

①异常反差。 由于荷电效应，二次电子发射受到不规则影响，造成图像一部分异常亮，另一部分变暗。

②图像畸形。 由于静电场作用使电子束被不规则地偏转，结果造成图像畸变或出现阶段差。

③图像漂移。 由于静电场作用使电子束不规则偏移引起图像的漂移。

④亮点与亮线。 带电样品常常发生不规则放电，结果图像中出现不规则的亮点和亮线。

通过长期、大量的实验，我们发现减少荷电效应的方法：

①导电法。 用金属镀膜、导电染色等方法使样品本身导电，使吸收电子通过样品台流向“地”，从而消除荷电效应。生物样品几乎都采用这种方法，但不是能完全消除。

②降低电压法。 把加速电压降低，使V0 = V02，λ= 1 ，入射电子数与二次电子发射数相等，就不产生电荷积累，消除荷电效应。通常使用加速电压为1～5 kV。但因此会使分辨率下降。

③快速观测法。 以尽快的速度观测和拍摄，使荷电效应影响不大时结束。一旦出现较明显的荷电效应只能改变观察区域或更换样品。另外，应尽可能使用低倍观察。因为倍数越大，扫描范围越小，荷电越迅速，影响越大。

图2a所示为一生物样品由于荷电效应所产生的图像畸形与亮线，可以很明显的看出图像中、下部分发生明显移位畸形并散在分布数条亮线；图2b所示为在经过金属镀膜、加速电压由15kV降为10kV后同一观察部位图像。图像畸形与亮线已全部消除。

图2 　样品荷电效应

2、损伤

扫描电子显微镜观测时，样品可能受到的损伤有：

(1) 真空损伤。 生物样品从大气中放入真空中时，就会产生真空损伤，主要是由于样品干燥引起的。

(2) 电子束损伤。 电子束的能量引起照射点的局部加热、化学结合的破坏等，造成样品的破裂或局部漂移。

减少损伤常用方法有：

(1) 临界点干燥法。 此法能快速干燥样品，减少样品收缩变形。

(2) 降低加速电压及较小电子束流。

(3) 加厚喷镀金属膜。

图3所示为沙虫卵细胞膜在加速电压为15kV，电流在110mA 时，由于电子束的能量引起照射点的局部加热导致细胞膜表面膨胀破坏，可见图像中部一巨大隆起；图4则为将加速电压由15kV降为10kV，电流降为60mA，减少同一部位观测时间后，卵细胞膜真实的表面形态。

3、边缘效应

样品表面凹凸变化大的边缘区域，二次电子散射区域与样品表面接近的面积增大，结果使边缘区域二次电子发射异常地增加。在图像中这些区域特别亮，造成不自然地反差，称为“边缘效应”。这虽然并非由于操作引起地图像缺陷，但可通过适当地操作尽量减少。主要方法是降低加速电压，这可以使边缘效应相对减轻。图5所示为纳米复合材料冲击断口的图像，可见由于断口表面高低不平，边缘区域由于二次电子发射异常增加导致样品边缘异常增亮，无法显示出样品细节；图6为将加速电压由15kV降低为5kV后的图像，边缘效应明显减轻，但未能完全消除。

4、结束语

荷电效应、损伤、边缘效应为扫描电子显微镜图像常见的图像缺陷，这些缺陷一些是人为因素产生，一些则是由于扫描电子显微镜成像原理而不可避免产生，但我们都能通过一定的方法，如导电法、降低电压法、快速观测法等等而消除或减少图像缺陷的产生。在实际操作中，对于不同的图像缺陷，要灵活采用各种不同的方法，反复实验，并总结、分析各种方法的优劣，才能拍摄出更好、更真实的图片。