琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA

【实验目的】

通过实验掌握琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的原理与方法。

【实验原理】

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物（如下图所示）。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的凝胶。

琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。

琼脂糖凝胶的分离范围较广，选择不同凝胶浓度和装置，从50个碱基对到几兆不同长度的DNA都可以实现分离。使用电场强度和电泳方向恒定的水平板琼脂糖凝胶电泳的方法，可以很好的分离长度在50-20,000 bp 的DNA片段。

DNA在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响。例如DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

用低浓度的荧光染料如溴化乙啶染色后，凝胶中的DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20pg的双链DNA。

【实验材料】

1. 实验器材

水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；55℃水浴；沸水浴；微量移液器

2.实验试剂

（1）DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；1x电泳缓冲液TBE；6x样品缓冲液

（2）溴化乙锭：水中加入溴化乙啶，搅拌数小时至溶解。将配好的10 mg/ml溴化乙啶溶液装在棕色瓶中，室温保存，使用时稀释至0.5μg/ml。

【实验操作】

1. 照厂家说明准备好灌胶模具，置于水平面上（实验操作示意图如下）。

2. 配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶，加入100ml TBE缓冲液，称取1克琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在55℃水浴中保温。在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度3~5mm，避免气泡产生。

3. 室温放置30~45分钟，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水平板电泳槽。

4. 在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面1mm，拔下梳齿形成样品池。

5. 取样品与6X样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样品池中。

6. 盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压1－5V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端1cm时，切断电源。

7. 从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于0.5ug/ml溴化乙啶水溶液中，室温下振摇染色30~45分钟。

8. 回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。

【注意事项】

1. 溴化乙啶是一种强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴手套。

2. 紫外线对人体，尤其是眼睛有危害性。为减少紫外线照射，必须确保紫外线光源受到遮蔽。

【思考】

影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些，分别有怎样的影响？