文库构建和模板准备

克隆染色体DNA片段随机文库的构建对于基因组测序的成功至关重要。如果有可能，随机文库最好由机械剪切的片段构建，因为酶切DNA片段化会因为基因组中限制性酶切位点的非随机分布而有所偏向。如果为了生长率差异和体外重排最小而在狭窄的尺寸范围内有相对小的插入，质粒文库最有可能实现完全随机化。

如果插入片段至少是平均测序长度的2倍，而且允许每一模板可从没有冗余的两端测序，这样可以显著减少工作量。序列对的产生对于组装鸟枪法数据集也很重要，当出现序列对中的一条在一个毗连序列群中而另一条在不同的毗连序列群中的情况时，可以确定毗连序列群的顺序和方向，也可以估计插入间隙的大小。

通常要求从两个不同插入长度的文库中得到两批鸟枪法序列片段，典型的是2kb和lOkb的插入序列。这是小插入片段的随机性和克隆完整性与lOkb插入片段的过量重复和中间区域连接能力的折中办法。

在剪切之后，基因组DNA用激酶进行末端预处理，再用T4 DNA聚合酶处理，在1％低熔点琼脂糖中进行电泳，选择大小适当的片段。

有一种用来改进基因组文库质量的方法，其基本方法是将BstⅪ接头连在剪切后的DNA上，接着对DNA进行凝胶电泳纯化，去除过量的接头；这时带有3’―CACA单链末端的DNA片段被插入带有3， ―TGTG单链末端的BstⅪ线性化载体中。

接头连接策略将质粒文库中嵌合和无插入的比率降到很低的水平，插入DNA因为没有相对应的4bp单链末端，因而不能自连接形成嵌合体；同样，载体DNA也不能在没有插入的情况下自连接形成质粒。20ng的线性载体与1m01经过修饰的插入DNA通常产生含有近50 000 000克隆的文库。含有100 000 000或更多克隆的文库可以简单地通过规模化的连接反应获得。

有时从其他类型文库中生成的序列覆盖范围较小，这对于那些基因组DNA不适应大肠杆菌环境的物种很有用。避开这一问题的方法是用前面描述的方法建立50kb序列的文库，但是要用限制性内切酶(BglⅡ)进行消化，酶切不会切断载体，但是会切断50kb的插入片段(多次)。

加入BamHⅠ卡那霉素抗性序列组件(cassette)，并在37℃连续加入BglⅡ的条件下进行连接。当BglⅡ―BglⅡ连接发生时插入片段会被连续切断，而BamH I―BglⅡ连接不会被切断。这样就可以得到高产量的内部被切除的环状文库分子，其中残存的插入末端被卡那霉素抗性元件分隔开。

除选择内部被切除的质粒外，插入的抗性元件因为将两个插入末端分隔开，可以防止产生嵌合体重组。将内部被切除的文库置于含有氨苄西林/羧苄西林和卡那霉素(15ug/ml)的琼脂上培养，可产生相对均匀的大克隆，并且可以像小插入质粒文库一样进行扩增和测序。

这种方法显著增强跨越重复区和大范围连接的能力，是一种跨越基因组DNA中不能克隆区域的有效方法。

鸟枪法测序构建50kb相连克隆文库

在把50kb插入片段连人载体后，插入片段用限制性内切酶(BglⅡ)进行消化，通常在50kb插入片段中切断数次。加入BamHI卡那霉素抗性序列组件，在37~C连续加入BglⅡ的条件下进行连接。当BglⅡ―BglⅡ连接发生时序列组件会被连续切断，而BdmHI―BglⅡ连接不会被切断。

可以得到高产量含有内部切除的环状文库分子，其中插入片段的残存末端被卡那霉素抗性元件分开

Amp--氨苄西林选择标记；Kan--卡那霉素选择标记

自基因组文库中分离DNA模板可有多种方法。TIGR将碱性溶解法(Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989)改进后用于384孔板，TempliPhi法(AmershamBiosciences)成为效率最高且最稳定的方法，也可以在高通量生产环境中实现自动化。

高纯度质粒DNA由液体细菌培养制备。这一过程可以手工进行，也可以使用DNA纯化机械臂工作站(robotic work-station)，例如Thermo CRS。在碱性溶解法中，细菌细胞被溶解，细胞碎片可离心清除，质粒DNA可以从经异丙醇沉淀处理的溶解产物中获得。

DNA沉淀物用70％的乙醇清洗，干燥，重新用含有微量蓝色葡聚糖的10mmol／L Tris―HCl缓冲液悬浮。使用这种方法典型的每一克隆的质粒DNA产量约是600～800ng，这就提供了足够对每一模板进行至少4次测序反应的DNA数量。

现今在TIGR，使用机械臂工作站可以在12h周期内生成30 000条DNA模板。TempliPhi DNA测序模板扩增工具组以DNA扩增的重复循环模式为基础。这套工具组包括Phi29 DNA聚合酶、随机六聚体引物、dNTP和反应缓冲液。恒温DNA扩增在30~C进行4～6 h，产生1～3/IgDNA，足够进行多次测序反应。

模板的生产质量通过评价细胞增长和对每一生产批次进行DNA采样来监测。文库质量通过三个步骤评价。首先，质粒插入片段通过有限消化切除，检查是否出现插入片段，大小是否合适。其次，有少量克隆(如96或384)被测序，评测生成高质量序列的成功率。

还可以自公共数据库中搜索这些序列，以确定它们是否来自目标有机体。最后，将生成大量的序列(基因组每1Mb中约有1000个序列)组装，并检验其在基因组中的随机性和样品间的适度重叠情况。如果这些步骤都没有问题，就进行高通量测序。