DNA浓度与纯度的紫外分光光度计法分析

一、实验目的

学习利用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，掌握浓度和纯度的计算方法和实验操作技术。

二、实验原理

组成核酸的碱基(G, A, T, C）在260 nm处具有强吸收峰，所以通过测定260 nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同，因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。

核酸样品中最常有的其它吸光物质为蛋白质，由于蛋白质在280 nm处具有强吸收峰，因此测定A260/A280比率，可以判断DNA的纯度。纯化的DNA及RNA的A260/A280 比值应分别接近1.8 及2.0，当溶液中含有蛋白质时，会造成A260/A280 比值降低。

计算原溶液的浓度（A）：

转换因子：双股DNA为50 μg/ml；单股DNA或RNA为40 μg/ml

计算原溶液的摩尔数（以500 bp大小的DNA片段为例）：

每个脱氧核苷酸的平均分子量近似为324.5，因此分子量=500×324.5=162250

摩尔浓度(mol/L)=A/162250×1000

三、实验 仪器

1、紫外-可见分光光度计

2、移液器16套（每2人1套）

四、实验材料

1、无菌枪头20 μL各2支；

2、离心管

五、实验 试剂

1、无菌水

2、待测DNA溶液

六、实验步骤

1、取标准λDNA，稀释，待用。

2、制作标准曲线（教师完成！）

3、取实验一提取的基因组DNA，稀释50倍后待用。

4、测定A260和A280