石蜡包埋组织的DNA提取及其应用
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近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA 的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA 甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA 或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节 不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA ，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA 研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史。
而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节重点讨论石蜡包埋组织DNA 提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA 提取的基本方法
从石蜡包埋组织中提取DNA 的基本步骤，是在常规DNA 提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA 提取技术（表1），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA 虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA 释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法。
将不适于做分子杂交的降解的DNA 小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA 大分子，从而提高了DNA 质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA 之点杂交结果一致，非螺旋化DNA 亦不影响杂交分析。
表1 Gpelz氏DNA 提取方法的主要步骤
| 1．切除多余石蜡，暴露组织 |
| 2．将组织切碎（最大径<0.5mm），称重； |
| 3．溶于TE9提取液（组织<50mg/5ml,50～500mg/10ml）,高速混悬2～3min；于48℃ 放置24h，其制备见表18-6； |
| 4．再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h； |
| 5．用等体积酚-氯仿溶液抽提3次； |
| 6．2.5倍体积乙醇沉淀DNA |
| 7．-70℃放置2～4h |
| 8．9000×g离心1h |
| 9．沉淀物用70%乙醇洗1次 |
| 10．干燥，TE（pH7.2）溶解。 |
表2 TE9 DNA 提取液的制备
| 500mmol/L | Tris |
| 20mmol/L | EDTA |
| 10mmoo/L | NaCl |
| 1% | SDS |
| 500μg/ml | 蛋白酶K |
| PH8.0 |
5μm组织切片
↓
常规脱蜡、水化
↓
第一次溶液A孵育（去上清）
↓
第二次溶液A孵育（留上清）
↓
氯仿-异戊醇抽提
↓
RNA酶和蛋白酶消化
↓
酚抽提
↓
沉淀
↓
（却除未螺旋化DNA ）
↓
透析
溶液A
| 2×SSC |
| 100μg 蛋白酶K/ml |
| 1% SDS |
