犬乙型肝炎表面抗原(HBsAg)酶联免疫分析（ELISA）
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犬乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 酶联免疫分析（ELISA ）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定犬血清，血浆及相关液体样本中 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 水平 。
实验原理：
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ ELISA ）测定标本中犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 。用纯化的犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 抗体 包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 相结合 ，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后 再与 HRP 标记的 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 抗体 结合，形成抗原 - 抗体 - 酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（ OD 值），与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 的存在与否。
试剂盒组成 ：
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试剂盒组成 |
48 孔配置 |
96 孔配置 |
保存 |
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说明书 |
1 份 |
1 份 |
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封板膜 |
2 片（ 48 ） |
2 片（ 96 ） |
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密封袋 |
1 个 |
1 个 |
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酶标包被板 |
1 × 48 |
1 × 96 |
2-8℃保存 |
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阴性对照 |
0.5ml × 1 瓶 |
0.5ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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阳性对照 |
0.5ml × 1 瓶 |
0.5ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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酶标试剂 |
3 ml × 1 瓶 |
6 ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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样品稀释液 |
3 ml × 1 瓶 |
6 ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂 A 液 |
3 ml × 1 瓶 |
6 ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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显色剂 B 液 |
3 ml × 1 瓶 |
6 ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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终止液 |
3ml × 1 瓶 |
6ml × 1 瓶 |
2-8℃保存 |
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浓缩洗涤液 |
（ 20ml × 20 倍）× 1 瓶 |
（ 20ml × 30 倍）× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
样本处理及要求 ：
1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持 2-8℃的温度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（ 2000-3000 转 / 分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可 将标本放于-20 ℃保存，但 应避免反复冻融 .
7. 不能检测含NaN3的样品 ，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（ HRP ）活性。
操作步骤：
1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、 阳性对照 2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50μl 。然后在 待测样品孔先加样品稀释液 40 μl ，然后再加待测样品 10 μl 。 加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，
3. 温育：用封板膜封板后置37 ℃温育3 0 分钟。
4. 配液：将 30 （ 48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 600ml 后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl ，空白孔除外。
7. 温育：操作同 3 。
8. 洗涤：操作同 5 。
9. 显色：每孔先加入显色剂 A 50μl ，再加入显色剂 B 50μl ，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 分钟
10. 终止：每孔加终止液 50μl ，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零， 450nm 波长依序测量各孔的吸光度（ OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。
结果判定：
试验有效性：阳性对照孔平均值 ≥1.00; 阴性对照平均值 ≤0.10
临界值（ CUT OFF ）计算：临界值 = 阴性对照孔平均值 +0.15
阴性判定：样品 OD 值 < 临界值（ CUT OFF ）者为犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 阴性
阳性判定：样品 OD 值 ≥ 临界值（ CUT OFF ）者为犬 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 阳性
注意事项
1 ．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2 ．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3 ．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5 ．底物请避光保存。
6 ．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm
7 ．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。
保存条件及有效期
1 ．试剂盒保存： ； 2-8℃。
2 ．有效期： 6 个月
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