酶免疫细胞化学染色操作指南

一、材料和试剂

1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。

2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。

4、0.01M pH7.4 PBS

5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）

6、AEC底物

（1）底物缓冲液（20X） PH 4.6

醋酸（分子量60.6） 30.6ml

Triton X-100

醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克

加蒸馏水到960ml，调pH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml。

（2）AEC（20X）

AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中）

（3）0.6% H2O2（20X）

临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。

7、DAB（即DAB-4HCL）

（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）

（2）1M Tris（20X），用HCl调PH到7.4

（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。溶解后（可加热到50℃），加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或400C保存。

8、苏木素复染液

苏木素 1克

碘酸钠 0.2克

钾矾 50克

水 1000ml

9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。

10、3% H2O2：30% H2O21份，加9份双蒸水，临用时配。

11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板

12、封片液：1克明胶，溶于30ml 35℃水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。

二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）

1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或37℃ 10-15分钟，使恢复温度。

2、加3% H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。

3、室温10分钟后，甩掉 H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。

三、封闭

细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置37℃孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。

四、免疫化学染色

1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜；

2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100 mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（100 ml），如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次；

3、加SP试剂（SP法，即放大法）

（1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37℃孵育30分钟；

（2）按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干；

（3）加已优选好浓度的SP试剂，用量同“（1）”，37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干；

4、间接法加二抗（不放大法）

方法同SP法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略（3）步骤；

5、加底物显色

（1）加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，细胞培养板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+++” ），用自来水即可终止反应；

（2）复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝，最后在蒸馏水中漂洗。

6、封片

洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油—明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。

五、结果判断

阳性——诱导细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导阳性细胞（1-30%）；阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色（排除边缘效应）

六、注意事项

1、一抗、二抗的稀释采用1% BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS；

2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）；

3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）；

4、对照系统，必须要做的对照系统：阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清；阴性对照：（1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液；（2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照：空白对照：不加一抗，用1%BSA替代；无关对照：与本项目无的第一抗体。