电化学发光免疫测定

电化学发光免疫测定(electrochemiluminescence immunoassay，ECLl)是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物。ECLI中标记物的发光原理与一般的化学发光(CL)不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光2个过程。

ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。在电化学发光免疫测定中应用的标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌，其衍生物N—羟基琥珀酰胺(NHS)酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合，制成标记的抗体或抗原。ECLI的测定模式与ELISA相似，分2个步骤进行。现以双抗体夹心法测定TSH抗原为例介绍ECLI反应原理。

第1步：耦联有活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+N—羟基琥珀酰胺酯(NHS)的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育。

第2步：将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素与亲和素的结合，将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心。

第3步，蠕动泵将形成的[Ru(bpy)3]2+抗体—抗原—抗体—磁珠复合体吸人流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3] 2+结合的抗体)也被吸出测量室。

紧接着，蠕动泵加入含三丙胺(TPA)的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。

发光剂[Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面，可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使2价的[Ru(bpy)3] 2+被氧化成3价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA被氧化成阳离子自由基TPA…，后者很不稳定，可自发失去1个质子(H+)，形成自由基TPA·，这是一种很强的还原剂，可将1个电子给3价的[Ru(bpy)3)3] 2+，使其形成激发态的[Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。

激发态的[Ru(bpy)3] 2+通过荧光衰减机制，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3] 2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3] 2+的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。

ECLI具有以下优点：

①标记物可再循环利用，使发光时间更长，强度更高，易于测定；

②敏感度高，可达pg/ml或pmol水平；

③线性范围宽，可达>104单位；

④反应时间短，20min以内可完成测定；

⑤试剂稳定性好，2～5℃可保持1年以上。目前ECLI不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针的检测。