电化学发光免疫测定原理

一、概念 　　电化学发光免疫测定(Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI)。
　　ECLI 是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术。电化学发光法源于电化学法和化学发光法，而ECLI 是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光二个过程。
　　ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针检测。

二、反应底物
　　ECL 反应底物有两种：
　　·三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺络合物：
　　钌(Ruthenium, Ru)，原子序数44，原子量101.07。元素名来自拉丁文，原意是"俄罗斯"。1827年俄国化学家奥赞在铂矿中发现钌；1844年俄国化学家克劳斯肯定它是一种新元素。钌在地壳中的含量约为十亿分之一，是铂系元素中含量最少的一个。钌常与其它铂系元素一起分散于冲积矿床和砂积矿床中。钌有7种天然稳定同位素：钌96、98、99、100、101、102、104。
　　钌为银白色金属，熔点2310℃，沸点3900℃，密度12.37×10³/m³。
　　钌的化学性质不活泼，在空气和潮湿环境中稳定；不溶于酸和王水，溶于熔融的强碱、碳酸盐、氰化物等；加热到900℃，时能与氧反应；加热时能与氟、氯、溴反应；钌有形成配位化合物的强烈倾向，还有良好的催化性能。
　　钌是铂和钯的有效硬化剂；金属钛中加入0.1%的钌就可大大提高耐腐蚀性；钌钼合金是一种超导体；含钌的催化剂多用于石油化工。
　　·三丙胺(Tripropylamine，TPA)：
　　结构式：

三、电化学发光反应原理
　　电化学反应过程：在工作电极上(阳极)加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]²⁺ 释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]³⁺，同时，电极表面的TPA也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基 TPA⁺ ，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基 TPA·，这样，在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]³⁺ 和具有强还原性的三丙胺自由基 TPA·。

 

　　化学发光过程：具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]³⁺ 和具有强还原性的三丙胺自由基 TPA· 发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]³⁺ 还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]²⁺，其能量来源于三价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]³⁺ 与三丙胺自由基 TPA· 之间的电势差，激发态 [Ru(bpy)₃]²⁺ 以荧光机制衰变并以释放出一个波长为 62Onm 光子的方式释放能量，而成为基态的 [Ru(bpy)₃]²⁺。

　　循环过程：上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]²⁺ 和三丙胺(TPA)，使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行，这样，整个反应过程可以循环进行。
　　通过上述的循环过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大提高，所以 ECL 测定具有高灵敏的特点。

四、电化学发光免疫原理
　　上述的电化学发光过程产生的光信号的强度与二价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]²⁺ 的浓度成线性关系。

 

　　将二价的三氯联吡啶钌　[Ru(bpy)₃]²⁺　与免疫反应体系中的一种物质结合，经免疫反应、分离后，检测免疫反应体系中剩余二价的三氯联吡啶钌 [Ru(bpy)₃]²⁺ 经上述过程后所发出的光，即可得知待检物的浓度。