双脱氧链终止法测定DNA序列的实验方法

放射自显影及结果分析

将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。可将凝胶切下一小角以示方向。

在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。

于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。然后由下而上读序。

注意事项

1．操作顺序参考表

① 制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。

② 检查实验计划及试剂。

③ 预电泳。

④ 预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。

⑤ 点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。

⑥ 固定、干燥凝胶。

⑦ 放射自显影。

2．M13重组子的培养

① 挑取单一的大肠杆菌集落加入3ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。

② 取200μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测DNA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。

③ 通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。存放4℃待用。

3．单链模板的分离

① 沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。

② 分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100ul，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。小心将上层液转移至另―干净离心管中。用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。

加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。

加1/10体积3mol、L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。

加入20ulTris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。

用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。

4．放射自显影及结果分析

将凝胶板自电泳槽取下后水平放置，小心分离两块玻板，让凝胶完好地留在其中一块玻板上。可将凝胶切下一小角以示方向。

在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸，移去玻板，在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜，注意排除气泡。滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。

于暗室中，将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合，夹在增感屏盒中，置70℃或室温曝光4-16小时，然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行)，水漂洗、干燥。然后由下而上读序。

注意事项

1．操作顺序参考表

① 制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。

② 检查实验计划及试剂。

③ 预电泳。

④ 预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。

⑤ 点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。

⑥ 固定、干燥凝胶。

⑦ 放射自显影。

2．M13重组子的培养

① 挑取单一的大肠杆菌集落加入3ml LB培养基中，37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。

② 取200μl上述大肠杆菌培养物，加入含有2ml 2×YT培养基的试管中，再将插入待测DNA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中，在37℃剧烈振荡培养至少5小时，但不宜超过8小时。

③ 通过两轮离心将细胞除去，第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。存放4℃待用。

3．单链模板的分离

① 沉淀M13：在上述M13培养物上清中，加入0.2倍体积的3.5mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液，颠倒混匀数次，置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11000g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液，可将试管倒置并吸去多余液体。

② 分离纯化模板：向沉淀中加入TE缓冲液100ul，轻轻混匀使沉淀重悬，(以下步骤可在微量离心管中进行)。再加等体积酚/氯仿试剂，旋转振荡30秒，离心1分钟使分层。小心将上层液转移至另―干净离心管中。用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。

加等体积氯仿，离心，转移上层液至洁净管中，并重复1次。

加1/10体积3mol、L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇，混合，置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟，离心10分钟，除去上清，加冰冷的70%乙醇lml，离心，除去上清，于真空条件短暂干燥。

加入20ulTris缓冲液溶解DNA沉淀，储于-20℃待用。

用于测序的DNA，其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。