用sephadex G-25脱盐，如何选择缓冲液

1) 如果我用sephadex G-25脱盐，如何选择缓冲液？

因为我认为，如果选择含盐的缓冲液，本身带入了盐，能起到脱盐的效果吗？如果选择含盐的缓冲液，

缓冲液里含有的盐会最后流出来吗？

另外，分子筛有没有载量的问题？

缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么特别的要求.你的缓冲液当然是没有盐的,否则那何必除盐呢.含盐缓冲液当然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.

如果你缓冲液中有盐那虽然盐有后出的原理,但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是不一样的.

分子筛其实也有载量的问题,但是关键还是看上样的体积,例如分离上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,具体的数和样品有很大关系.

2) 既然这样，我想完全脱盐时，洗脱液可以选择水吗？因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在，对不对？

是的,只要你的样品在水中溶解得很好,而且很稳定,那选择水就可以.

3) 请教色谱兄，我现在用纤维素分离纯化蛋白和peg-蛋白，跑完我用page检测了一下，没有完全分开，有一些是一起流出来的，我想知道为什么分离效果不好？我该如何调整阿？加长柱子可行吗？还是要更换介质阿？我用的梯度洗脱。多谢拉！

peg-蛋白要想完全分开是比较困难的,因为PEG修饰的程度不一样,所很难完全分开,不过纤维素分离的效果是要差点,你可以通过延长柱子,降低流速,延长梯度的办法来提高分辨率,不行你可以换琼脂糖系列的,但是我觉得你也可以考虑疏水,这两个方法都可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱,这样有时候分离效果也不比梯度的差.

4) 非常感谢色谱兄，琼脂糖的比纤维素的好很多吗？另外，上次你给我了份材料没有价格，能否给份有价格的材料，这样也好和老板谈谈，因为老板控制的挺严，谢谢！！

有的，到时候发给你吧。琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好，载量也大，还有就是柱床体积不会变化，流速高。

5) 想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离（制备规模），且不使用plasmidselect之类亲和介质。

亲和是最有效的方法，我们有现成的工艺，包括去内毒素，你可以把你的邮件pM给我，我给你发一份相关的材料，你可以看看。

6) 我所纯化的蛋白质大概是66kDalton，进行的亲和纯化。现在出现几个问题想请教：

1。用的Ni-NTA进行亲和纯化，以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带，现在50mM就有，是不是我的镍柱不太好使。

2。因为亲和纯化后我的蛋白在最上面，所以我现在用sephadex G－100，但是我发现效果很差，不仅回收率低，而且也只有小分子量的杂带能去掉。因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带，而且我想把我的蛋白去结晶，那样要求的纯度就很高。这样的话是不是选用的纯化材料不对，而且对于流速和柱子长度要求就很严格了。

有可能你的载量下降了，所以才那样，你需要清洗了。

我觉得你最好选择新的填料，其实你要是条件好的话，仅一步就可以纯化到95%，我可以把我们的方法告诉你，你pM你的邮件给我就好了。

7) 1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都没办法洗下来，异丙醇也试过了，还有什么好方法？

2。在跑RP-HPLC的时候，如果样品的盐浓度太高了，有影响么？

那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100％的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.

ACN 中含有1％的TFE。

有可能是蛋白变性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？

不过在用isopropanol洗的时候，会有一些峰，但好像总是洗不干净

column 是专门用来纯化蛋白的，是C4。 不知道孔径是多少，不过C4的应该都差不多把。

我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.
我想柱子应该没有问题.方法也没有错.

8) 想请教细胞外基质中的蛋白怎样抽提。

这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.

9) 请问聚乙二醇的检测波长是多少？

聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.

10) 怎么有效的去除蛋白溶液中的triton?超滤加PB洗涤是否是一种有效的方法？

你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.

用冷的丙酮沉淀蛋白，那么丙酮容易去掉吗？如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton，可行吗？

丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.

11) 那么，mPEG-maleimide的检测波长是多少？

maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了.

12) 我现在想纯化一种蛋白，我的蛋白是14kD的碱性蛋白质，流程是这样的：原核细胞内蛋白表达，裂解细胞，SP-sepharose盐离子层析，HPLC Mono S过柱，去盐，HPLC C18过柱，最后得到纯化的蛋白。上面是一个成熟的protocol，我一直没有做过蛋白纯化，所以想向斑竹请教，HPLC上样量这么小，我有5ml的量，要多久才完成？

我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.

13) 你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白，大小为42kD（包括GST)，大肠杆菌表达，我想请教一下其纯化方法。

那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.

14) 有没有比较好的国产疏水层析填料，当然是做蛋白的？

国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.
(责任编辑：大汉昆仑王)