姊妹染色单体色差测定

互联网2013-03-07

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一、实验原理

在DNA复制过程中，核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine简称BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2′-deoxyuridine简称IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的DNA链，并占有胸腺嘧啶（Thymidine，T）的位置。

哺乳类细胞在含有适当浓度的BrdUrd的培养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的DNA双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股DNA的T位完全由BrdUrd代替，而另一条染色单体的两股DNA中的一股含BrdUrd，另一股则不含 BrdUrd。

这样的细胞经过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股DNA链都含有BrdUrd的单体荧光较强，其中只有一股有BrdUrd的单体荧光较弱。

但由于荧光染料发出的荧光消失较快，只能立刻在荧光显微镜下照相而不能长期保存。1974年Korenberg和Freedlender改进了这一技术，单独用Giemsa染色即获得姐妹染色单体差别染色（sister-chromatiddifferentialstaining简称SCD）。

来自一个染色体的两条单体之间同源片断的互换称为姐妹染色单体互换（sister-chromalidexchange，简称SCE）。这种互换是完全的，对称的。由于姐妹染色单体染色上的明显差异，如果姐妹染色单体间在某些部位发生互换，则在互换处可见有一界限明显、颜色深浅对称的互换片段，故SCE易于计数，即使在一定距离内发生多次互换，也可被检测出来。

目前认为SCE反映了DNA的损伤，可以使用SCE作为哺乳类动物突变形成的指标。由于SCE分析方法比观察染色体畸变更简便、迅速、敏感，并表现出很好的剂量效应关系，因此，目前已将此法列为检测诱变剂或致癌物的常规指标之一。

二、实验试剂

1. RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、链霉素，姬姆萨染液等。

2. 小牛血清：最好经过透析处理。将小牛血清装入透析袋中，用线扎紧封口，小心检查，切勿有漏孔。然后将透析袋放在盛有双重蒸馏水的玻璃器皿中，每隔1—2小时换一次水，搁置在4℃冰箱中，24小时后赛氏滤器灭菌过滤。

3. 3.5% NaHCO3溶液：称3.5克NaHCO3，用100毫升双蒸水溶解，10磅15分钟高压灭菌，调节pH用。

4. BrdUrd 溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下用分析天平称取BrdUrd2毫克，然后在无菌室内加入灭菌生理盐水4毫升，母液的浓度为0.5毫克/毫升。用黑布避光，置冰箱中保存。最好现配现用。

5. 1 mol/LNaH2PO4，pH8.0的溶液；称取120克NaH2PO4，加入1 000毫升双蒸水，用NaOH粉末调pH至8.0即可。

6. 2×SSC溶液（0.3 mol/L氯化钠，0.03 mol/L枸橼酸钠，称取NaCl 17.54克，枸橼酸钠8.82克，各用蒸馏水1 000毫升溶解，使用时两溶液等量混合。

7. pH为6.8 的mol/L/15磷酸缓冲液：

甲液：取KH2PO49.08克，溶于1000毫升蒸馏水中。

乙液：取Na2HPO2·2H2O11.88克或Na2HPO4·12H2O23.87克，溶于1 000毫升蒸馏水中，将50.8毫升的甲液与49.2毫升乙液混合，即得pH为6.8的mol/L/15磷酸缓冲液。

三、实验设备

1. 2毫升和1毫升灭菌注射器

2. 吸管，移液管，离心管

3. 量筒，烧杯

4. 无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶

5. 酒精灯

6. 载玻片

7. 天平

8. 紫外灯（15 W）

9. 离心机

10. 恒温培养箱

11. 显微镜

四、实验材料

人的外周血。

五、实验步骤

1. 在无菌条件下，用20毫升的青霉素瓶分装5毫升培养液，其中RPMI1640占80%；小牛血清占15-20%；PHA 0.2毫升；青霉素 100单位/毫升；链霉素100微克/毫升。最后用3.5% NaHCO3调节pH至7.2-7.4。

2. 每5毫升的培养液中加入BrdUrd0.1毫升，最终浓度为10微克/毫升。

3. 每瓶培养液中加入0.3毫升静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即置37℃温箱中培养。

4. 培养72小时左右，加入秋水仙素0.4-0.8微克/毫升，继续培养4小时。

5. 按常规收集细胞，用0.075 mol/LKCl或蒸馏水低渗20分钟，用甲醇：冰醋酸3：1配制的固定液固定两次，每次15分钟，用气干法制片，一天以后将染色体制片放入70-80℃烤箱中烘烤1-2小时，或放在37℃温箱中存放备用。

6. 染色体标本的差别染色方法有两种：

（1）碱的热溶液处理：将染色体标本浸在88℃的 1 mol/LNaH2PO4（pH为8.0）的溶液中，处理20分钟，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规Giemsa染色5分钟，再用蒸馏水冲洗，干燥，观察。

（2）紫外灯照射诱发：染色体标本在37℃条件下搁置24小时后取出，放在45—48℃的水浴锅上，覆盖一层2×SSC溶液（0.3 mol/LNaCl，0.03 mol/L枸橼酸钠），15 W紫外灯照射20-30分钟，灯管与载玻片之间距离为6厘米（照光期间防止2×SSC溶液干涸）。照射完毕，用蒸馏水冲去2×SSC，用3%Giemsa（pH6.8磷酸缓冲液稀释）染色5—10分钟，水洗，气干后镜检。

7. 在普通光学显微镜下观察，可见姊妹染色单体呈现鲜明的深浅不同的颜色。

六、注意事项

1. 在本方法的基础上，如将培养基组成、培养液的酸碱度、培养温度或培养时间等因素略加变动，可适用于其他一些哺乳动物、鸟类或两栖类动物淋巴细胞的培养，用以观察它们的姊妹染色单体色差。例如中华大蟾蜍淋巴细胞培养时，所用的培养基组成除RPMI1640外，还补充一定量的水解乳蛋白，培养基的pH为7.0-7.2，培养温度为26℃。

2. BrdUrd溶液最好现配现用，一次使用不完，必须有黑布避光，4℃冰箱保存。

3. BrdUrd在培养开始时加入，或在培养后的24小时加入均可。

4. 用紫外灯照射诱发姊妹染色单体互换时，如紫外灯功率大，W数高，照射的时间就相应地减少。