非特异性荧光染色的消除

组织的非特异性荧光染色机制很复杂，其产生的原因主要有：一部分荧光素末与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，不能被除去；抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白与组织成分结合；

除被检抗原以外，组织中还存在类属抗原(如Forssman抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合；从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致抗体不纯；

抗体分子上标记的荧光素分子太多，因过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织，因而呈现非特异性荧光染色；荧光素不纯、标本固定不当等其他因素。由于目前多使用商品化荧光标记抗体，所以，研究者主要在荧光染色过程中，注意避免产生非特异性荧光染色。常用方法如下：

1．荧光抗体稀释法 先检测荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性。

2．伊文氏蓝衬染法 采用FITC等荧光探针时，可用此方法。用含0．0l％伊文氏蓝(Evans blue)的PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染成红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明对比，减少了非特异性荧光。

但在进行激光扫描共聚焦显微镜观察时最好不用此法，因为在目标荧光进行叠加时有一定影响。伊文氏蓝一般先配成1％溶液，保存于4℃，用前再稀释至0．01％。

3．其他 染色中要充分洗涤，采用胰酶消化组织切片或用10％牛血清白蛋白封闭等可以消除非特异性染色，提高特异性染色。