TILLING-高通量点突变筛选方法

TILLING- 高通量点突变筛选方法

反向遗传学方法是功能基因组研究的重要方法。为了克服传统的基因敲除方法的局限性，TILLING（Targeting Induced Local Lesions In Genomes）技术通过化学诱变的方法产生的大量点突变个体，可以对部分功能缺失的基因及基因分型中亚致死等位基因进行研究。

目前，TILLING技术已被大量应用于拟南芥、果蝇、玉米、斑马鱼、苜蓿等多个物种的研究领域。

Ecotilling- 高通量SNP 发现新方法

SNP可以用来研究物种间不同个体的遗传差异，疾病基因找寻，重要性状相关基因定位等。SNP的找寻需要获得大量个体DNA样本的序列信息，通过大规模测序，可以获得足够的序列信息，从而筛选出SNP。但是该方法耗费巨大，耗时较长。

Ecotilling技术的出现，解决了传统测序的缺陷，不仅分析速度更快，而且耗费很低，尤其适合大规模人群和动植物群体中找寻新的SNP位点，它和Tilling的区别是，Ecotilling使用的材料是自然环境中的群体，而非突变体，后续的实验技术流程与TILLING相同

高质量的的TILLING/Ecotilling图像

双色红外荧光检测，产生两个真实的凝胶电泳图像。未经加工的原始图像防止了突变被过滤得可能性。

双色检测消除假阳性结果

错配的异源双链经酶切后，产生两个片段。两个片段由不同的荧光标记（如右图）。泳道的两条突变片段分子量之和应该等于野生型的分子 量，满足条件方可以确定突变。

突变定位

成像程序可以识别存在突变样品位点的泳道并估算条带的分子量，进行突变位点的定位分析。

高灵敏度的红外检测

红外技术的高灵敏度避免了一些弱信号的丢失。与其他可见荧光相比较 ，红外技术具有更宽的动力学范围，弱的突变条带和强的野生条带同时生成高质量的图象。

技术成熟

我们所采用的Licor遗传分析系统是TILLING/Ecotilling技术的最佳选择。拟南芥Tilling计划（ATP）已经用Licor 4300找到了200多个基因的2000多株突变株。

拟南芥的TILLING流程操作示意图

Ecotilling的流程从步骤4开始，没有诱变的过程。后续实验过程与TILLING相同。