聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定IgG纯度

互联网2012-03-12

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（一）原理

由于聚丙烯酰胺凝胶的浓度可以按要求配制，因此可以形成“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统。“不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率。这种电泳的主要特点是：

（1）使用两种不同浓度的凝胶系统；

（2）配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9。

电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳液缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。

电泳时，蛋白质样品放置在浓缩胶上，为防止蛋白质样品在电极缓冲液中扩散，因而加入等体积的40%蔗糖或50%甘油与之混合，以提高密度；为观察蛋白质样品泳动的情况，样品中还加入溴酚蓝等示踪染料，这些有色物质的分子比任何一种大分子物质泳动的速度都快，只要染料未泳动出凝胶管，样品就没有走出胶管的危险。

在不连续系统中，当接通电源开始电泳时，系统中的甘氨酸、蛋白质、HCl中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动。其迁移率取决于离子的电荷数、分子量大小及形状。

然而，当电极缓冲液（pH8.3）中的甘氨酸离子在进入浓缩胶时，它们遇到了比pH8.3低的pH(6.7)，pH下降了近两个单位，几乎接近于甘氨酸的等电点（5.97），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷量明显减少，迁移率减慢。

血清样品中个蛋白质成分也进入浓缩胶，pH的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸要小得多，其迁移率比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。

浓缩胶中的Tris-HCl中的Cl-则全部解离，分子量很小，摩擦力不大，其迁移率比蛋白质、溴酚蓝都快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成：甘氨酸<蛋白质<溴酚蓝<cl-的顺序。<> 甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动离子流的突然缺失，出现电流减小电导率下降。然而，整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根据电导及电位梯度成反比（E=I/n，E为电位梯度，I为电流强度，n为电导率）的关系，于是在前导离子Cl-离子与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血清蛋白质各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度（分子量不同、带电量不同）泳向前导Cl-离子区域。当到达前导Cl-区域时因不缺少离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢下来，其结果在甘氨酸和Cl-离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小堆积或浓缩成层。通过这个过程，是蛋白质样品浓缩了好几百倍，且蛋白质各成分也按一定的顺序排列成层。 当离子流继续向前，进入以pH8.9缓冲液配制的小孔胶时，蛋白质分子在小孔胶里遇到阻力，迁移率减慢，同时在pH8.9条件下，甘氨酸又充分解离，其带电量增加，消除了离子流缺失的现象，小分子的甘氨酸离子赶上了蛋白质。凝胶各部分恢复具有恒定的电场强度，蛋白质的分离完全按一般区带点用方式进行。 由以上的原理可见，聚丙烯酰胺凝胶的不连续电泳最主要的优点就是使蛋白质样品经浓缩胶后，形成紧密地压缩层进入分离胶。蛋白质各成分预先分开且压缩成层，可以减少在电泳时，成分间由于自由扩散而造成的区带相互重叠所带来的干扰，这样就提高了电泳的分辨能力。由于这个优点，少量的蛋白质样品（1-100??g）也能分离得很好，分辨率高使血清蛋白质可获得近20多个区带。 （二）试剂和器材 1．测试样品血清蛋白、脱盐后的IgG、纯化后的IgG。 2．试剂 （1）制备分离胶、浓缩胶有关试剂 ① 凝胶缓冲液：称取1mol/L HCl 48ml，Tris（三羟基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶，4℃贮存。 ② 分离胶贮液：28%Arc-0.735%Bis储液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml。过滤后置棕色试剂瓶中，4℃ 贮存，一般可放置1个月左右。 ③ 分析纯过硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶，4℃储存仅能用一周，最好当天配制。上述3种试剂用于制备分离胶。 ④ 浓缩胶缓冲液：称取1mol/L HCl 48ml，Tris5.98g，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,调pH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶内，4℃贮存。 ⑤ 浓缩胶贮液：称Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，过滤后置棕色瓶内，4℃贮存。 ⑥ 40%蔗糖溶液（W/V） ⑦核黄素溶液核黄素4.0mg，加重蒸馏水溶解，定容至100ml，置棕色试剂瓶内，4℃贮存。 （2）Ph8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液 称Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸馏水至900ml，调pH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置试剂瓶中，4℃贮存，临用前稀释10倍。 （3）0．1%溴酚蓝指示剂 （4）染色液染色液种类较多，染色方法也不完全相同。本实验采用0.05%考马斯亮蓝R250染色液中，含20%磺基水杨酸，其优点是染色、固定同时进行，背景易脱色。0.5%考马斯亮蓝R250的20%磺基水杨酸染色液：考马斯亮蓝0.05g，磺基水杨酸20g，加蒸馏水至100ml，过滤后置试剂瓶内保存。 （5）脱色液 7%乙酸溶液 （6）保存液甘油10ml，冰乙酸7ml，加蒸馏水至100ml。 （7）1%琼脂（糖）溶液琼脂（糖）1g，加已稀释10倍的电极缓冲液，加热溶解，4℃贮存，备用。 3．器材电泳仪夹心式垂直板电泳槽