原理
从种子中提取的醇溶蛋白在凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下得到良好的分离,通过显色显示蛋白质谱带类型。不同品种由于遗传组成不同,种子内所含的蛋白质种类有差异,这种差异可利用电泳图谱加以鉴别,从而对品种真实性和纯度进行鉴定。
材料与仪器
步骤
一、仪器和试剂:
1、仪器:电泳仪(满足稳压500V)、离心机、垂直板电泳槽、钳子、5ml、10ml移液管、微量进样器、聚丙烯离心管。
2、试剂:尿素,乙醇,甘氨酸,甲基绿,三氯乙酸,冰乙酸,过氧化氢,硫酸亚铁,抗坏血酸,α-氯乙醇。
3、药剂配制:
(1)蛋白质提取液:
小麦:0.05克甲基绿溶于25毫升α-氯乙醇中,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
大麦:0.05克甲基绿溶于20毫升α-氯乙醇中,加入118克尿素,再加入1毫升β-巯基乙醇,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
(2)电泳缓冲液:0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解,加4毫升冰乙酸,定容至1000毫升。低温保存。
(3)凝胶缓冲液:1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解,加20毫升冰乙酸,定容至1000毫升。低温保存。
(4)0.6%过氧化氢:30%过氧化氢2毫升,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
(5)染色液:0.25克考马斯亮蓝加25毫升无水乙醇溶解,加入50克三氯乙酸,加水至500毫升。
(6)凝胶液:丙烯酰胺20克,甲叉双丙烯酰胺0.8克,尿素12克,硫酸亚铁0.01克,抗坏血酸0.2克,用凝胶缓冲液溶解并定容至200毫升。低温保存。
二、实验步骤:
1、样品提取:
一般每个样品测定100粒种子,若更准确地估测品种纯度,则需更多的种子。如果分析结果要与某一纯度的标准值比较,可采用顺次测定法(sepuential testing)来确定,即50粒作为一组,必要时刻连续测定数组,以减少工作量。如果只鉴定真实性,可用50粒。
取小麦或大麦种子,用钳子逐粒夹碎(夹种子时最好垫上小片清洁的纸,以便于清理钳头和防止样品之间的污染),置1.5毫升离心管中,加入蛋白质提取液(小麦0.2毫升,大麦0.3毫升)充分摇动混合,在室温下提取24小时,然后在18000×g条件下离心15分钟。取其上清液用于电泳。
2、凝胶制备:
从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢液,吸取10毫升凝胶溶液,加1滴0.6%过氧化氢,摇匀后迅速倒入封口处,稍加摇动,使整条缝口充满胶液,让其在5-10分钟聚合封好。
吸取45毫升凝胶溶液,加3滴0.6%过氧化氢,迅速摇匀,倒入凝胶板之间,马上插好样品梳,让其在5-10分钟内聚合。
3、进样:
小心抽出样品梳,将玻璃板加在电泳槽上,用滤纸或注射器吸取样品槽中多余的水分,然后用微量进样器吸取10-20μl样品加入样品槽中。
4、电泳:
在前后槽注入电极液,前槽接正极,后槽接负极。然后打开电源,逐渐将电压增到500V电泳时,要求在15-20℃温度下进行。电泳时间一般为60-80分钟,具体时间可按甲基绿迁移时间来推算,电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的2-2.5倍。
5、染色:
将胶板小心的取下,在染色液中染色1-2天。一般情况不需要脱色,但为使谱带清晰,可用清水冲洗。
三、鉴定:
谱带命名可采用相对迁移率法,或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性,并与标准样品电泳图谱比较,坚定种子真实性以及测定品种纯度。
1、仪器:电泳仪(满足稳压500V)、离心机、垂直板电泳槽、钳子、5ml、10ml移液管、微量进样器、聚丙烯离心管。
2、试剂:尿素,乙醇,甘氨酸,甲基绿,三氯乙酸,冰乙酸,过氧化氢,硫酸亚铁,抗坏血酸,α-氯乙醇。
3、药剂配制:
(1)蛋白质提取液:
小麦:0.05克甲基绿溶于25毫升α-氯乙醇中,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
大麦:0.05克甲基绿溶于20毫升α-氯乙醇中,加入118克尿素,再加入1毫升β-巯基乙醇,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
(2)电泳缓冲液:0.4克甘氨酸加蒸溜水溶解,加4毫升冰乙酸,定容至1000毫升。低温保存。
(3)凝胶缓冲液:1.0克甘氨酸加蒸溜水溶解,加20毫升冰乙酸,定容至1000毫升。低温保存。
(4)0.6%过氧化氢:30%过氧化氢2毫升,加蒸溜水至100毫升。低温保存。
(5)染色液:0.25克考马斯亮蓝加25毫升无水乙醇溶解,加入50克三氯乙酸,加水至500毫升。
(6)凝胶液:丙烯酰胺20克,甲叉双丙烯酰胺0.8克,尿素12克,硫酸亚铁0.01克,抗坏血酸0.2克,用凝胶缓冲液溶解并定容至200毫升。低温保存。
二、实验步骤:
1、样品提取:
一般每个样品测定100粒种子,若更准确地估测品种纯度,则需更多的种子。如果分析结果要与某一纯度的标准值比较,可采用顺次测定法(sepuential testing)来确定,即50粒作为一组,必要时刻连续测定数组,以减少工作量。如果只鉴定真实性,可用50粒。
取小麦或大麦种子,用钳子逐粒夹碎(夹种子时最好垫上小片清洁的纸,以便于清理钳头和防止样品之间的污染),置1.5毫升离心管中,加入蛋白质提取液(小麦0.2毫升,大麦0.3毫升)充分摇动混合,在室温下提取24小时,然后在18000×g条件下离心15分钟。取其上清液用于电泳。
2、凝胶制备:
从冰箱中取出凝胶溶液和过氧化氢液,吸取10毫升凝胶溶液,加1滴0.6%过氧化氢,摇匀后迅速倒入封口处,稍加摇动,使整条缝口充满胶液,让其在5-10分钟聚合封好。
吸取45毫升凝胶溶液,加3滴0.6%过氧化氢,迅速摇匀,倒入凝胶板之间,马上插好样品梳,让其在5-10分钟内聚合。
3、进样:
小心抽出样品梳,将玻璃板加在电泳槽上,用滤纸或注射器吸取样品槽中多余的水分,然后用微量进样器吸取10-20μl样品加入样品槽中。
4、电泳:
在前后槽注入电极液,前槽接正极,后槽接负极。然后打开电源,逐渐将电压增到500V电泳时,要求在15-20℃温度下进行。电泳时间一般为60-80分钟,具体时间可按甲基绿迁移时间来推算,电泳时间为甲基绿移至前沿所需时间的2-2.5倍。
5、染色:
将胶板小心的取下,在染色液中染色1-2天。一般情况不需要脱色,但为使谱带清晰,可用清水冲洗。
三、鉴定:
谱带命名可采用相对迁移率法,或电泳程式法。根据醇溶蛋白谱带的组成和带型的一致性,并与标准样品电泳图谱比较,坚定种子真实性以及测定品种纯度。
来源:丁香实验