免疫组化没有任何着色的解决办法！
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DAB是否有效，可通过DAB直接与二抗反应，若不显色，则是DAB有问题或是二抗有问题， 是否DAB失效或是二抗浓度太低，可更换DAB或提高二抗浓度。排除这两者原因，再摸索最佳条件。
首先要弄明白，所谓的DAB染色是怎样来的，DAB和过氧化氢是HRP的底物，可以说有三个环节 1：DAB是否在有效期，和是否被稀释，后者就要求片子要擦干，甩干，这样才能保证DAB的有效浓度。 2：如果不是用DAB试剂盒，一定要注意要加过氧化氢，并保证其浓度 3：要保证HRP的存在和足够，这就需要你一抗有效和组织要有抗原表达，二抗和三抗要有最适的浓度 建议你找一张标准的片子看一下，可能目前你还不清楚你自己要染什么，你要染的是你的组织中分布的抗原，不是背景，如果你要求的抗原都未染出，还要求背景做啥？ 免疫组织的特异性染色指抗体只与相应的靶抗原决定簇反应，与其他抗原决定簇不起反应，组织切片内只有含靶抗原的部位染色才阳性。理想的免疫组织染色只有特异性反应的染色，阳性产物反应强，背景清晰。因而两者能形成鲜明对比。凡不属于上述特异性反应的染色，通常称为非特异性或背景着色。 无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能： 1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。 2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。 假阴性结果又可分为两种情况： （1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。 （2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达； 或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体； 或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。 为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。 如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。 反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。 自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。 另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。 因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。 为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。 另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 我做免疫组化时也碰到过完全没有着色的情况，多为抗原未修复或一抗的问题，所以应该特别注意。 首先，你确定整个片子呈黄色不是正常的，角膜厚度要注意，再者我还想说一点一抗即用型，这种东西我不是很放心，你试试把一抗浓度稀释下，不要完全迷信一抗即用型，因为组织不同，一抗浓度也不可能一样，很多情况都是抗体浓度没掌握好。 我自己曾经按照说明书的推荐浓度（1：50~1：150）上下2个数量极摸索，我一直到1：1000才做出最好的效果，经历是惨痛的，呵呵~~ 抗体孵育时间，我个人感觉不是做不做得出来的问题，而是效果好坏的问题，有的资料说4度过夜，不仅结合的牢固，而且非特异染色少。 我想这可能和某些抗原有关吧，但是你可以37度1~2个小时试试看，要有早就有了，不要浪费时间试4度的，我到是怀疑你组织抗原表达问题（因为你的冰冻切片好像有，老大，何谓好像有？），会不会你的标本模型没做好？或者固定时间过长？固定方式不合理？ DAB显示看你是什么试剂盒，不同试剂盒的时间要求有所不同；不同组织染色时间也不同。 免疫组化最重要的是预实验摸条件的时候。需要摸索的条件包括：一抗浓度和孵育时间，反应过程中某些细节时间或要求（如过氧化物封闭时间、热抗原修复次数等—）、DAB显色时间。 滴上DAB之后，应该马上在镜下观察显色情况。判断标准是：最好有标准的图片（文献或试剂说明），根据标准和你染的组织进行判断。阳性的结果不是一片黄染，你应该是过染了，原因或者是一抗浓度高了，或者DAB显色时间太长了。 我不清楚的是为什么你在镜下看是一片黄色，封片后变成透明。 |
