ELISPOT技术的发展历史

ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。1983年，在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。

一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。

另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky （Czerkinsky CC et. al., 1983a）。前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；

而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究中。虽然研究的对象不一样，但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT几乎完全相同。

这二十多年来，ELISPOT基本技术并没有什么重大变化，但是技术进步一直没有停顿，实验材料的改进了，实验灵敏度与重复性提高了，实验应用领域也拓宽了。

（1）底板材质的改进

ELISPOT技术从创立之初，检测底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验的灵敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 将膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。他们引入的是硝酸纤维素膜，获得了远远优于塑料板的结果。

1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队（该团队后来挂靠Utrecht大学，创办了荷兰U-Cytech公司，成为世界上顶级的ELISPOT试剂盒生产商之一）把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了ELISPOT检测中（Schielen P et. al., 1995）。

做过Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白吸附性质，更加精细的显色条带分辨率。因此，PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。至今，PVDF膜几乎完全取代了NC膜（Weiss AJ 2005）。

“反者道之动”。塑料板在被膜板取代之后，沉寂了许多年，现在又开始兴旺起来了（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。最著名的塑料ELISPOT板当数荷兰U-Cytech公司研发的透明板，已经成为了该公司的一大特色。

塑料ELISPOT板的重新兴旺有两个方面的原因：一方面是技术进步，在塑料材质的改进之后，板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了很大提高，虽然还赶不上膜板，但是应付ELISPOT实验已经绰绰有余。更高质量的抗体也有利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。

另一方面归因于塑料板自身的优势，相对低廉的价格，简化的操作步骤，简短的实验时间都是塑料板的优势（Ronnelid J et. al., 1997）。此外对于透明板，还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度，这对新手是很重要的。

（2）检测内容的多样化

在ELISPOT技术创立之初，主要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体，包括各种类型的免疫球蛋白，包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。

B细胞分泌的抗体一般的量比较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测的灵敏度不够高，检测大量分泌的抗体还是不成问题的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。

时至今日，ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分泌情况（Holmgren J et. al., 2005）。后来随着技术的进步，ELISPOT检测的灵敏度有了大幅度的提高，以至于可以检测到痕量的细胞因子，于是它的主要应用就转移到检测细胞因子上来了（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）。

现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。

能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素（γ-IFN）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、颗粒酶（Granzyme B）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。

目前全球ELISPOT试剂盒的主要供应商有：荷兰U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美国BD Pharmingen公司和R&D公司。他们的产品各有特点，其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉，在国内市场居于主导地位。

（3）多细胞因子的检测

通常的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种或者两种以上的细胞因子，可以包被两种抗体以捕获两种细胞因子，然后用两种不同的酶联抗体以及显色剂显出两种斑点来。早在1988年，Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了这种想法（Czerkinsky C et.al,. 1988b）。

但是，双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点，那就是斑点分离的问题。大家知道，斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题，两种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合，会出现一系列不同的表观颜色。其中的细微差异，人的肉眼有时候都难于判断，何况是自动的读板仪。

所以，在双色ELISPOT斑点识别上，总会有些混色的斑点无法正确的识别与分类。为了解决这个难题，人们想到了用荧光元及检测ELISPOT的方法（Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994）。

不同颜色的荧光混合在一起，只要加一张滤光片，就可以精确的滤出目标荧光，而遮蔽掉其它颜色的荧光，荧光之间可以互不干扰。这对于双因子，甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段（Gazagne A et. al., 2005）。

但是荧光ELISPOT检测目前还有不足之处。由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上，缺乏酶催化底物的那种放大作用，所以灵敏度还无法和化学显色的ELISPOT方法比较（Gazagne A et. al., 2005）。此外，硝酸纤维素膜自身在激发下就会发荧光，所以不适合做荧光ELISPOT底板材料。

PVDF膜也有自身发荧光的问题，虽然不像硝酸纤维素膜那样严重，但是也会造成背景升高，信噪比下降的问题（Gazagne A et. al., 2005）。荷兰U-Cytech公司已经发开出了新一代的荧光底板介质Hydrogel?，它既有很高的抗体吸附性质，又没有荧光背景。

Hydrogel?目前存在的唯一问题是保存起来不够稳定，限制了它的推广。综上所述，多细胞因子检测是ELISPOT未来的一个发展方向，但在技术上还不够成熟，有待于改进。