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ELISPOT技术的发展历史

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ELISPOT方法从创立至今已经有20多年的历史了。1983年,在地球南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立的创立了这项技术。

一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth,牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich (Sedgwick JD et. al., 1983)。

另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg,带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky (Czerkinsky CC et. al., 1983a)。前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况(Holt PG et. al., 1984;Sedgwick JD et. al., 1984);

而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况(Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c),还应用于大肠杆菌分泌肠毒素(Czerkinsky CC et.al., 1983a)和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白(Czerkinsky CC et. al., 1984)的研究中。虽然研究的对象不一样,但是该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在的标准ELISPOT几乎完全相同。

这二十多年来,ELISPOT基本技术并没有什么重大变化,但是技术进步一直没有停顿,实验材料的改进了,实验灵敏度与重复性提高了,实验应用领域也拓宽了。

(1)底板材质的改进

ELISPOT技术从创立之初,检测底板都是使用的普通塑料板,它的蛋白吸附能力差,因此实验的灵敏度有限。1985年,Moller SA和Borrebaeck CA 将膜板引入ELISPOT中(Moller SA et. al., 1985),检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。他们引入的是硝酸纤维素膜,获得了远远优于塑料板的结果。

1995年,荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队(该团队后来挂靠Utrecht大学,创办了荷兰U-Cytech公司,成为世界上顶级的ELISPOT试剂盒生产商之一)把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也被引入了ELISPOT检测中(Schielen P et. al., 1995)。

做过Westernblot的人都知道,PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优的蛋白吸附性质,更加精细的显色条带分辨率。因此,PVDF的引入是继硝酸纤维素膜之后,ELISPOT底板材料的又一次重大突破(McCutcheon M et. al., 1997)。至今,PVDF膜几乎完全取代了NC膜(Weiss AJ 2005)。

“反者道之动”。塑料板在被膜板取代之后,沉寂了许多年,现在又开始兴旺起来了(Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997)。最著名的塑料ELISPOT板当数荷兰U-Cytech公司研发的透明板,已经成为了该公司的一大特色。

塑料ELISPOT板的重新兴旺有两个方面的原因:一方面是技术进步,在塑料材质的改进之后,板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了很大提高,虽然还赶不上膜板,但是应付ELISPOT实验已经绰绰有余。更高质量的抗体也有利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。

另一方面归因于塑料板自身的优势,相对低廉的价格,简化的操作步骤,简短的实验时间都是塑料板的优势(Ronnelid J et. al., 1997)。此外对于透明板,还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度,这对新手是很重要的。

(2)检测内容的多样化

在ELISPOT技术创立之初,主要用于检测B淋巴细胞分泌的抗体,包括各种类型的免疫球蛋白,包被的材料是特异性的抗原或者抗体的抗体(Holt PG et. al., 1984;Sedgwick JD et. al., 1984)。

B细胞分泌的抗体一般的量比较大,容易检测,即使早期ELISPOT检测的灵敏度不够高,检测大量分泌的抗体还是不成问题的(Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a)。

时至今日,ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分泌情况(Holmgren J et. al., 2005)。后来随着技术的进步,ELISPOT检测的灵敏度有了大幅度的提高,以至于可以检测到痕量的细胞因子,于是它的主要应用就转移到检测细胞因子上来了(Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989)。

现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒,使用起来非常方面。

能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素(γ-IFN)、白介素(IL-2,4,5,6,10,12等)、颗粒酶(Granzyme B)、肿瘤坏死因子(TNF-α)。

目前全球ELISPOT试剂盒的主要供应商有:荷兰U-CyTech公司、瑞典Mebtech公司、法国Diaclone公司、美国BD Pharmingen公司和R&D公司。他们的产品各有特点,其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉,在国内市场居于主导地位。

(3)多细胞因子的检测

通常的ELISPOT检测每个孔只检测一种细胞因子。如果要在一个ELISPOT孔内同时检测两种或者两种以上的细胞因子,可以包被两种抗体以捕获两种细胞因子,然后用两种不同的酶联抗体以及显色剂显出两种斑点来。早在1988年,Cecil C. Czerkinsky就提出并且实现了这种想法(Czerkinsky C et.al,. 1988b)。

但是,双色ELISPOT有一个与生俱来的弱点,那就是斑点分离的问题。大家知道,斑点的混合色属于物理学上“颜料的三原色”问题,两种不同颜色的颜料如果以不同的比例混合,会出现一系列不同的表观颜色。其中的细微差异,人的肉眼有时候都难于判断,何况是自动的读板仪。

所以,在双色ELISPOT斑点识别上,总会有些混色的斑点无法正确的识别与分类。为了解决这个难题,人们想到了用荧光元及检测ELISPOT的方法(Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994)。

不同颜色的荧光混合在一起,只要加一张滤光片,就可以精确的滤出目标荧光,而遮蔽掉其它颜色的荧光,荧光之间可以互不干扰。这对于双因子,甚至多因子ELISPOT检测都是十分理想的手段(Gazagne A et. al., 2005)。

但是荧光ELISPOT检测目前还有不足之处。由于荧光素直接偶联在抗体或者亲和素上,缺乏酶催化底物的那种放大作用,所以灵敏度还无法和化学显色的ELISPOT方法比较(Gazagne A et. al., 2005)。此外,硝酸纤维素膜自身在激发下就会发荧光,所以不适合做荧光ELISPOT底板材料。

PVDF膜也有自身发荧光的问题,虽然不像硝酸纤维素膜那样严重,但是也会造成背景升高,信噪比下降的问题(Gazagne A et. al., 2005)。荷兰U-Cytech公司已经发开出了新一代的荧光底板介质Hydrogel?,它既有很高的抗体吸附性质,又没有荧光背景。

Hydrogel?目前存在的唯一问题是保存起来不够稳定,限制了它的推广。综上所述,多细胞因子检测是ELISPOT未来的一个发展方向,但在技术上还不够成熟,有待于改进。

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