溴化乙啶染色
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溴化乙啶染色
1.原理
溴化乙啶(ethidium bromide,EB)是最常用的嵌入性荧光染料,活细胞或固 定细胞均能从极稀溶液中摄取EB染料,DNA螺旋暂时弯曲允许EB荧光染料嵌入大分 子疏水中心的碱基对之间。
标本经强酸(0.25mol/LHCl,pH 0.6)水解破坏RNA后,可特异 地显示DNA,而标本经0.1mol/L盐酸的无水甲醇处理(55℃,3小时),使DNA甲基化,则 可阻止DNA染色,此时EB仅与RNA结合,可特异地显示RNA。
2.溶液配制
(1)EB储存液
EB 2.0mg
0.01mol/LPBS(pH 7.2) 5.0ml
(2)EB工作液(终浓度为1ug/m1)
EB储存液 125rd
0.01mol/LPBS(pH 7.2) 50ml
3.操作程序
(1)DNA染色操作程序
1)单层细胞培养标本,用醋酸―乙醇或Carnoy固定液固定;
2)0。25moi/L HCl处理;
3)0.01mol/LPBS漂洗3次,每次3~5分钟;
4)将标本置EB工作液中,室温染色15分钟;
5)0.01mol/LPBS漂洗3次,每次3~5分钟;
6)用甘油与PBS(1:9)混合液或水溶性封片剂封片,荧光显微镜观察分析。
结果:最大激发波长和最大发射波长分别为520nm和6lOnm,DNA呈橘红色荧光。
(2)RNA染色操作程序
1)组织细胞固定同上;
2)甲基化处理,阻止DNA染色:0.1mol/lHCl纯甲醇中,55~C,3小时;
3)漂洗同上;
4)标本置EB工作液中室温染色15分钟;
5)漂洗同前;
6)封片、荧光显微镜观察条件同前。
结果:使DNA甲基化后染色被阻止,此时RNA呈现橘红色荧光。