溴化乙啶染色

互联网2010-12-02

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溴化乙啶染色

1．原理

溴化乙啶(ethidium bromide，EB)是最常用的嵌入性荧光染料，活细胞或固定细胞均能从极稀溶液中摄取EB染料，DNA螺旋暂时弯曲允许EB荧光染料嵌入大分子疏水中心的碱基对之间。

标本经强酸(0．25mol／LHCl，pH 0．6)水解破坏RNA后，可特异地显示DNA，而标本经0．1mol／L盐酸的无水甲醇处理(55℃，3小时)，使DNA甲基化，则可阻止DNA染色，此时EB仅与RNA结合，可特异地显示RNA。

2．溶液配制

(1)EB储存液

EB 2．0mg

0．01mol／LPBS(pH 7．2) 5．0ml

(2)EB工作液(终浓度为1ug／m1)

EB储存液 125rd

0．01mol／LPBS(pH 7．2) 50ml

3．操作程序

(1)DNA染色操作程序

1)单层细胞培养标本，用醋酸―乙醇或Carnoy固定液固定；

2)0。25moi／L HCl处理；

3)0．01mol／LPBS漂洗3次，每次3～5分钟；

4)将标本置EB工作液中，室温染色15分钟；

5)0．01mol／LPBS漂洗3次，每次3～5分钟；

6)用甘油与PBS(1：9)混合液或水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察分析。

结果：最大激发波长和最大发射波长分别为520nm和6lOnm，DNA呈橘红色荧光。

(2)RNA染色操作程序

1)组织细胞固定同上；

2)甲基化处理，阻止DNA染色：0.1mol／lHCl纯甲醇中，55~C，3小时；

3)漂洗同上；

4)标本置EB工作液中室温染色15分钟；

5)漂洗同前；

6)封片、荧光显微镜观察条件同前。

结果：使DNA甲基化后染色被阻止，此时RNA呈现橘红色荧光。