马松染色实验（Masson 染色）

Masson 染色是结缔组织染色中最经典的一种方法,又称马松染色，是显示组织中纤维的主要方法之一，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。该法染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关，分子的大小由分子量来体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织;而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。

然而，淡绿或苯胺蓝的分子量都很大，因此 Masson 染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈绿色或蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。

Masson 三色染色方法，是胶原纤维和肌纤维的染色方法，能够对组织和病理组织进行胶原结构的观察。

而 Van Gieson 染色是利用两种阴离子染料混合或先或后作用而完成鉴别染色，使胶原纤维呈红色（被丽春红所染）肌纤维呈黄色（被苦味酸所染）。

弹力纤维与胶原纤维染色选用维多利亚蓝、丽春红和苦味酸组合双重染色方法使弹力纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈黄色。

材料：

1、Regaud 氏苏木精：苏木精 1 g，95% 酒精 10 ml，甘油 10 ml，蒸馏水 80 ml。将苏木精加入蒸馏水内加温溶解，冷却后加入酒精和甘油，放数日后即可应用。

2、Weigert 铁苏木素染色液：A 液：苏木素 1 g，蒸馏水 100 ml；（将苏木素溶于酒精，让其慢慢氧化成熟，约四周以后，便可以使用，或者用成熟的 10% 的苏木素酒精配制，即时可用）B 液：29% 三氯化铁水溶液 4 ml，蒸馏水 95 ml，盐酸 1 ml；使用前 A 与 B 液 1:1 现用现配。

3、Masson 丽春红酸性复红液：丽春红 0.7 g，酸性复红 0.3 g，蒸馏水 99 ml，冰醋酸 1 ml。

4、0.2% 冰醋酸水溶液：冰醋酸 0.2 ml，蒸馏水 100 ml。

5、1% 磷钼酸水溶液：磷钼酸 1 g，蒸馏水 100 ml。

6、苯胺蓝水溶液：苯胺蓝 2 g，蒸馏水 98  ml，冰醋酸 2 ml。

7、1% 光绿水溶液：光绿 1 g，蒸馏水 100 ml。

仪器：

烤片机、通风橱、免疫组化染色缸或盒、显微镜。

1、石蜡切片脱蜡至水：二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，二甲苯Ⅲ 5 min，无水乙醇 1 min，95% 乙醇 1 min，75% 乙醇 1 min，自来水冲洗数秒；

2、铬化处理或去汞盐沉淀（甲醛固定的组织此步可略）；

3、依次自来水和蒸馏水洗；

4、用 Regaud 苏木精染液或 Weigert 铁苏木素染色液染核 5~10 min；

5、1% 盐酸酒精分化 5~15 s，充分水洗；

6、滴加 0.1~1% 碳酸锂 5 min，增加反蓝程度，水洗；

7、用 Masson 丽春红酸性复红液 5~10 min；

8、以 2% 冰醋酸水溶液洗 1 min；

9、1% 磷钼酸水溶液分化 3-5 min，2% 冰醋酸水溶液洗 1 min；

10、不经水洗，直接用苯胺蓝水溶液或 1% 光绿水溶液染 1~2 min；以 0.2% 冰醋酸水溶液洗 1 min；

11、 95% 乙醇脱水 2~3 s，无水乙醇脱水 3 次每次 5 s，二甲苯透明 3 次每次 1 min、中性树胶封固。

结果：胶原纤维或蛋白、粘液、软骨呈蓝色（如光绿液染色为绿色），胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质和红细胞呈红色，胞核呈蓝紫色。

图1. Masson组织染色结果示例（最右列），可看到不同处理条件下胶原纤维（蓝色）和肌纤维（红色）的分布不同

图2. Masson 组织染色结果示例，本实验室组织样本染色结果

1、及时镜检以控制好染色程度。

2、组织固定起着很重要的作用，根据不同的固定液可延长或缩短染色时间。

3、0.2% 冰醋酸水溶液洗，可使色调清晰鲜艳。

4、磷钼酸水溶液对丽春红、酸性复红有分化作用，分化时镜下控制肌纤维和纤维素呈红色，胶原纤维呈淡粉红色即可，切勿过染。

1、蓝色染不上或者颜色浅：脱蜡不彻底，应适当增加脱蜡时间或更换新鲜的二甲苯；苯胺蓝染色时间过短或失效，更换新鲜的苯胺蓝或增加染色时间，苯胺蓝染色后应及时镜检，若颜色浅可再次复染。

2、细胞核不着色或颜色浅：染色时间过短，或苏木素失效，或分化时间太长。Weigert 铁苏木素染色液应现用现配，以防失效；可重新染色，将组织切片放入 0.01% 氢氧化钠、0.5% 氨水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液，每个 3~5 min，接着重新染色。可以适当增强组织的嗜碱性以增强核染色，如 Zenker 液固定的切片可放入 5% 碳酸氢钠溶液中 3 h，自来水冲洗 5~10 min 染色，或 Bouin 液固定的切片可放入 5% 碳酸氢钠溶液中 1 h，自来水冲洗 10 min 染色。

3、红色过深：Masson 丽春红酸性复红液染色时间过长，或分化时间不够，可适当减少染色时间或增加分化时间，染色时及时镜检以控制染色程度。